BaP和Cd單一復(fù)合對(duì)BaP蚯蚓亞細(xì)胞分配的影響

周麗娜 ,周 靜 ,劉瀟雅 ,常大麗 ,李輝信 ,胡 鋒 ,徐 莉 ,2* (.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 20095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 20095；3.浙江人欣檢測(cè)研究院股份有限公司,浙江 寧波 35000)

苯并(a)芘(BaP)和鎘(Cd)是土壤中常見(jiàn)的兩類(lèi)污染物.BaP是多環(huán)芳烴類(lèi)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)、分布最廣、性質(zhì)最穩(wěn)定的污染物.而Cd也是我國(guó)土壤無(wú)機(jī)類(lèi)污染的首要污染物,我國(guó)污染土壤普查[1]表明在630萬(wàn)km2被調(diào)查的土地上,有7%的點(diǎn)位被測(cè)出 Cd超標(biāo).此外,我國(guó)土壤的污染呈現(xiàn)無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)合污染的特點(diǎn)[2-3],特別是無(wú)機(jī)污染物與有機(jī)污染物中的多環(huán)芳烴、六六六、滴滴涕等的復(fù)合污染,現(xiàn)狀令人堪憂.不同污染物經(jīng)由工業(yè)排放、化肥施用、污水灌溉等途徑進(jìn)入農(nóng)田系統(tǒng),不僅對(duì)作物生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生不良影響,而且會(huì)通過(guò)食物鏈對(duì)人和動(dòng)物的健康構(gòu)成威脅,污染物的生態(tài)毒性研究也是目前環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[4-5].蚯蚓是土壤食物鏈的重要組成部分,是評(píng)估土壤污染物毒性的模式動(dòng)物[6],基于其的一系列規(guī)范化的蚯蚓毒性試驗(yàn)程序已經(jīng)建立并得到廣泛應(yīng)用[7-8].目前,國(guó)內(nèi)外的研究多集中于單一或復(fù)合污染對(duì)蚯蚓的生態(tài)毒性效應(yīng)[9-10],但對(duì)污染物進(jìn)入蚯蚓的途徑,以及污染物在蚯蚓體內(nèi)的分配積累特征研究不多.而不同類(lèi)型污染物的性質(zhì)差別會(huì)影響它們進(jìn)入蚯蚓體的途徑以及分布.在攝入途徑上,對(duì)無(wú)機(jī)類(lèi)污染物如重金屬,利用封口暴露方式處理陸正蚓,得到皮膚接觸吸收幾乎是蚯蚓攝入Cu和Pb的全部途徑,而對(duì)于Cd和Zn,蚯蚓最大有17%～30%的比例是經(jīng)口攝入[11-12].但對(duì)于有機(jī)污染物,隨著有機(jī)污染物疏水性的增強(qiáng),安德愛(ài)勝蚓經(jīng)腸道攝入污染物的途徑比重逐漸增加,經(jīng)皮膚途徑的攝入比重則逐漸減少[13].在污染物分配上,對(duì)于重金屬,如Cd主要分布在蚯蚓體內(nèi)的后消化道中[14],特別是蚯蚓的黃色細(xì)胞區(qū)域組織中[12].而有機(jī)污染物如多環(huán)芳烴,蚯蚓組織相比于土壤表現(xiàn)出更高的吸附性能[15].然而截止目前,僅有表明蚯蚓能夠積累滯留PAHs的研究,但少有 PAHs 在蚯蚓體內(nèi)分布行為的報(bào)道[16].

此外,有關(guān)攝入途徑和分布趨勢(shì)的研究主要集中于蚯蚓個(gè)體水平,而污染物在亞細(xì)胞水平上的分布,更有助于揭示蚯蚓對(duì)污染物的固定和解毒策略[17-20].對(duì)于 Cd,Li等[21]通過(guò)離心分離的方法,得到 Cd主要分布于細(xì)胞溶質(zhì)中;外加鈣離子以及鈣離子通道抑制劑氯化鑭(LaCl3)和巰基蛋白抑制劑 N-乙馬來(lái)酰亞胺(NEM)可以有效抑制Cd在蚯蚓亞細(xì)胞的積累.此外,金屬硫蛋白也有較多Cd的積累[22].而對(duì)于PAHs,本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明菲主要分布于細(xì)胞殘?bào)w碎片中[23].有機(jī)污染物可以改變蚯蚓細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,也能誘導(dǎo)金屬硫蛋白的生成[24-25],但是否存在與 Cd類(lèi)似的鈣離子通道或者與巰基等蛋白結(jié)合攝入等途徑還未有直接證據(jù).

相比單一污染,污染物復(fù)合也會(huì)影響污染物的分布.Cd和 BaP復(fù)合污染條件下,相比單一污染,菲律賓蛤仔中污染物的積累顯著增加,發(fā)生協(xié)同作用[26].而也有研究表明高濃度Cd和BaP復(fù)合污染會(huì)抑制污染物在蚯蚓體內(nèi)的積累,即產(chǎn)生拮抗作用[27].

因此,本研究擬以 BaP為目標(biāo)物,通過(guò)外加不同濃度鈣離子通道抑制劑氯化鑭(LaCl3)和巰基蛋白抑制劑 N-乙馬來(lái)酰亞胺(NEM),探究 BaP進(jìn)入蚯蚓的途徑;此外,設(shè)置Cd添加的復(fù)合污染,探究復(fù)合污染下BaP分布積累的變化.最終通過(guò)測(cè)定蚯蚓亞細(xì)胞水平上的 BaP積累分布情況,更好地評(píng)價(jià)BaP的毒性,并闡明BaP進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)的機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

赤子愛(ài)勝蚓購(gòu)自安徽蚯蚓養(yǎng)殖基地.選用大小及體重相近(300～500mg)成熟且?guī)в协h(huán)帶的健康蚯蚓作為受體.

BaP為分析純,純度為96%,購(gòu)于百靈威科技有限公司.氯化鎘(CdCl2)為分析純,純度為 99%,選自阿拉丁試劑.氯化鑭(LaCl3)為分析純,純度為99.9%,選自 Sigma試劑.N-乙馬來(lái)酰亞胺(NEM)為分析純,純度為99%,選自Sigma試劑.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)溶液培養(yǎng)方法并略加修改[28].50mg/L BaP模擬培養(yǎng)液配制如下:采用硝酸鈣(Ca(NO3)2)、硫酸鎂(MgSO4)、硝酸鈉(NaNO3)及硝酸鉀(KNO3)配制成 0.1mmol/L Ca2+,0.1mmol/L Mg2+,1.0mmol/L Na+及0.1mmol/L K+濃度的模擬液,BaP以丙酮溶解,溶于模擬液至終濃度為50mg/L,丙酮終濃度為1‰ V/V.含抑制劑模擬液,是在50mg/L BaP模擬培養(yǎng)液基礎(chǔ)上添加不同濃度的 LaCl3或 NEM,使得 LaCl3的最終濃度為 0, 20, 50,80μmol/L,NEM 的最終濃度為 0,5,10,15μmol/L.

復(fù)合污染模擬液是在50mg/L BaP模擬培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上,添加不同濃度的 CdCl2,使得 Cd2+終濃度為0, 0.2, 0.5, 0.8mg/L.抑制劑復(fù)合模擬液是在復(fù)合污染模擬液基礎(chǔ)上分別添加 LaCl3或NEM,LaCl3的最終濃度為 50μmol/L,NEM 的最終濃度為10μmol/L,備用.

暴露實(shí)驗(yàn)采用玻璃培養(yǎng)皿,每個(gè)培養(yǎng)皿中放入 10條蚯蚓(清腸 24h),用含有抑制劑的模擬液預(yù)暴露4h后,加入20mL污染物模擬水溶液并用封口膜封住,膜上扎上小口,防止蚯蚓逃逸且保證通氣,于(20±1)℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng).每天挑除死亡蚯蚓,并更換培養(yǎng)液,第 7d進(jìn)行采樣,用液氮?dú)⑺篮髢?chǔ)存于-70℃冰箱.每個(gè)處理設(shè)定4個(gè)重復(fù).1.3 亞細(xì)胞分組

本實(shí)驗(yàn)將蚯蚓分為 3個(gè)亞細(xì)胞組分.具體過(guò)程如下[29]:蚯蚓融化后放置于含有 5mL 冰冷的Tris-HCl(0.01mol/L, pH=7.0)緩沖液勻漿瓶中,在1500r/min條件下勻漿 5min (組織勻漿器DY89-2,寧波生物技術(shù)公司).然后勻漿液在高速冷凍離心機(jī)中(Sigma 3K 30,Sigma公司),分別在10000g, 4℃條件下離心30min,收集上清(細(xì)胞溶質(zhì)部分).得到的沉淀加入 2mL氫氧化鈉(NaOH)溶液(1mol/L)進(jìn)行充分消解,并繼續(xù)在高速冷凍離心機(jī)中,分別在10000g,20℃條件下離心10min,收集上清(細(xì)胞碎片部分)及沉淀(固體顆粒部分).收集的3個(gè)組分冷凍后置于 ALPHA 1-2LD plus冷凍干燥器中干燥.最后樣品儲(chǔ)存于-70℃冰箱中,等待進(jìn)一步測(cè)定.

1.4 BaP測(cè)定

BaP的提取參考 Contreras-Ramos等[30]的方法,并略加改動(dòng).蚯蚓經(jīng)過(guò)預(yù)處理后,將固體組分稱(chēng)重后與 3倍于其質(zhì)量的無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4)混合,置于研缽中磨成粉末.將粉末轉(zhuǎn)移到棕色玻璃離心管中(40mL,安捷倫公司,美國(guó)),加入 15mL二氯甲烷作萃取劑,密封.將離心管置于加有冰水的超聲波清洗器中進(jìn)行超聲萃取1h,然后在一個(gè)渦旋儀渦旋 60s,再次超聲1h,提取液在3500g條件下離心15min,提取上清液.此過(guò)程重復(fù) 2次.上清液合并后移取 6mL,過(guò)加有3g柱層層析硅膠的硅膠柱,用11mL 1:1的二氯甲烷和正已烷溶液分兩次洗脫;洗脫液收集至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,在 40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮至干.用2mL甲醇進(jìn)行溶解定容,過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜后上機(jī)分析.

BaP測(cè)定采用反相高效液相色譜(LC-20AT,日本Shimadzu公司)測(cè)試,并配有紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器(SPD-20A),色譜柱為 C18柱(Shim-pack VP-ODS,250×4.6mm,5μm),保 護(hù) 柱 為 C18 柱(Shim-pack GVP-ODS,10×4.6mm,5μm).色譜條件如下:流動(dòng)相為色譜純級(jí)甲醇,每次測(cè)樣前過(guò)0.45μm濾膜并超聲脫氣;在流速1.0mL/min下實(shí)行等度洗脫;柱溫 30℃;檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm;進(jìn)樣量20μL.根據(jù)出峰時(shí)間定性,根據(jù)峰面積由外標(biāo)法定量.檢測(cè)信號(hào)由 HW-2000色譜工作站(南京千譜軟件有限公司)記錄并處理數(shù)據(jù).

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用單因素方差分析法(one-way ANOVA)中的Duncan法進(jìn)行不同處理樣本間的差異顯著性分析(P<0.05),文中均采用Origin Pro 9.0軟件作圖.

2 結(jié)果

2.1 LaCl3對(duì)BaP分配積累的影響

圖1 單一污染下不同濃度LaCl3對(duì)蚯蚓各亞細(xì)胞組分中BaP分配積累的影響Fig.1 Effect of different LaCl3 concentrations on the distribution and accumulationof BaP in subcellular fractions of Eisenia fetida under the single pollution

不同處理下,BaP均主要積累在細(xì)胞碎片組分中,其次為固體顆粒組分和細(xì)胞溶質(zhì)組分(圖1,圖 2).單一 BaP污染下,與不添加 LaCl3處理相比,LaCl3的加入均不同程度促進(jìn)了亞細(xì)胞組分中BaP的積累(圖1).隨著LaCl3濃度的增加,固體顆粒組分中的BaP濃度呈先增加后減少的趨勢(shì),但均顯著高于不添加 LaCl3處理.而細(xì)胞溶質(zhì)組分和細(xì)胞碎片組分中 BaP的積累并不隨 LaCl3濃度的增加而增加.

圖2 Cd-BaP復(fù)合污染對(duì)蚯蚓各亞細(xì)胞組分中BaP的分配積累特征Fig.2 The distribution and accumulation of BaP in subcellular fractions of Eisenia fetida under the combined pollution of Cd and BaP

在不添加阻斷劑的條件下,復(fù)合污染下 Cd的加入,會(huì)抑制BaP在3個(gè)亞細(xì)胞組分中的積累(圖2A),這與前期研究一致[27].不添加Cd的處理,添加50μmol/L LaCl3后,細(xì)胞各組分中BaP的濃度都顯著增加,這與 LaCl3會(huì)抑制蚯蚓亞細(xì)胞組分對(duì) Cd的積累趨勢(shì)相反[33].Cd復(fù)合污染下,LaCl3的添加,會(huì)促進(jìn)蚯蚓3個(gè)亞細(xì)胞組分中BaP的積累.并且隨著 Cd濃度的增加,細(xì)胞溶質(zhì)組分中的BaP濃度呈逐漸上升的趨勢(shì),而固體顆粒和細(xì)胞碎片組分中的 BaP濃度呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖2B).

2.2 NEM對(duì)BaP分配積累的影響

不同處理下,BaP均主要積累在細(xì)胞碎片組分中,其次為固體顆粒組分和細(xì)胞溶質(zhì)組分(圖3).與不添加抑制劑的處理相比,NEM 的加入顯著促進(jìn)了亞細(xì)胞組分中BaP的積累,這與NEM會(huì)抑制蚯蚓亞細(xì)胞組分對(duì) Zn的積累趨勢(shì)相反[33].特別是在細(xì)胞碎片組分中.隨著 NEM 濃度的增加,細(xì)胞溶質(zhì)組分中的BaP濃度呈逐漸升高的趨勢(shì);固體顆粒組分中的BaP濃度呈先升高后降低的趨勢(shì),在5和10μmol/L NEM作用下BaP積累受到了顯著的促進(jìn);而細(xì)胞碎片組分中BaP的積累并不隨NEM濃度的增加而增加.

圖3 單一污染下不同濃度NEM對(duì)蚯蚓各亞細(xì)胞組分中BaP分配積累的影響Fig.3 Effect of different Nitrogen-ethylmaleimide concentrations on the distribution and accumulationof BaP in subcellular fractions of Eisenia fetidaunder the single pollution

在不添加阻斷劑的條件下,復(fù)合污染下 Cd的加入,會(huì)抑制BaP在3個(gè)亞細(xì)胞組分中的積累(圖2A).不添加Cd處理,添加NEM會(huì)能促進(jìn)各亞細(xì)胞組分中BaP的積累.Cd復(fù)合污染下,NEM的添加顯著抑制了細(xì)胞溶質(zhì)組分中BaP的積累;而固體顆粒組分中 BaP的積累先增加后減少,在0.2mg/L Cd作用下的BaP濃度達(dá)到最高;同樣在細(xì)胞碎片組分(Fraction E)中,BaP的積累也呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),在 0.5mg/L Cd作用下的BaP濃度達(dá)到最大(圖4).

圖4 Cd-BaP復(fù)合污染對(duì)蚯蚓各亞細(xì)胞組分中BaP分配積累特征(添加10 μmol/L NEM)Fig.4 The distribution and accumulation of BaP in subcellular fractions of Eisenia fetida under the combined pollution of Cd and BaP (with 10μmol/L Nitrogen-ethylmaleimideon )

3 討論

本研究結(jié)果顯示,不論是單一污染還是復(fù)合污染,BaP均主要集中積累在細(xì)胞碎片組分中,其次為固體顆粒組分,在細(xì)胞溶質(zhì)組分中的積累量最少.這與段曉塵[26]的研究結(jié)果一致,這可能是因?yàn)榧?xì)胞碎片組分中含有細(xì)胞膜等物質(zhì),具有較強(qiáng)的親脂性,易與疏水性的化學(xué)物質(zhì)相結(jié)合,而B(niǎo)aP是一種疏水性有機(jī)污染物,從而增加了 BaP在細(xì)胞碎片組分中的積累量[31-32].

Li等[33]研究表明在一定低濃度的Cd作用下,添加不同濃度的Ca2+能夠顯著促進(jìn)Cd在蚯蚓亞細(xì)胞組分中的積累,而 Ca2+在高濃度的 Cd作用下,反而會(huì)抑制 Cd的積累,這主要是因?yàn)轵球旧锬ど峡赡艽嬖趦煞N主要類(lèi)型 Cd的結(jié)合位點(diǎn),包括生理敏感位點(diǎn)和非特異性位點(diǎn),它們參與的蚯蚓體內(nèi) Cd積累過(guò)程不盡相同[34].低濃度條件下,Ca2+可以占領(lǐng)生物膜上的非特異性位點(diǎn)并阻止 Cd與非特異性位點(diǎn)的結(jié)合,從而增加了外界液體中的Cd濃度,反而促進(jìn)了Cd與生物膜上生理敏感位點(diǎn)的結(jié)合,從而促進(jìn) Cd的積累;而高濃度Cd作用下,Ca2+和Cd兩者在生理敏感位點(diǎn)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用顯著增加,從而會(huì)抑制了 Cd的積累[33].

本實(shí)驗(yàn)中,蚯蚓經(jīng)不同濃度的 LaCl3預(yù)暴露后,在 BaP單一污染作用下,3個(gè)亞細(xì)胞組分中BaP的積累得到促進(jìn)(圖 1),這與上述 Li等[33]研究結(jié)果相似,這可能是因?yàn)殁}離子通道阻斷劑LaCl3競(jìng)爭(zhēng)抑制了BaP與生物膜上的非特異位點(diǎn)結(jié)合,增加了外界液體中的BaP濃度,反而促進(jìn)了BaP與生物膜上生理敏感位點(diǎn)的結(jié)合,促進(jìn)了BaP的積累[33].在Cd-BaP復(fù)合污染條件下,Cd也能促進(jìn)BaP在3個(gè)蚯蚓亞細(xì)胞組分中的積累,這可能是因?yàn)镃d和LaCl3同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)并抑制了BaP與生物膜上的非特異性位點(diǎn)結(jié)合,增加了液體中的BaP濃度,反而促進(jìn)了BaP與生物膜上的生理敏感位點(diǎn)結(jié)合并促進(jìn)了BaP的積累.

與單一污染相比,復(fù)合污染條件下抑制劑LaCl3的添加同樣顯著促進(jìn)了3個(gè)亞細(xì)胞組分中BaP的積累,細(xì)胞溶質(zhì)組分和固體顆粒組分中BaP的積累趨勢(shì)相近.而在積累量最多的細(xì)胞碎片組分中,兩者卻表現(xiàn)出不同的趨勢(shì),復(fù)合條件下BaP的積累隨Cd濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖1,圖2B),這可能是因?yàn)榈蜐舛菴d與BaP競(jìng)爭(zhēng)生物膜上的非特異性位點(diǎn),促進(jìn)了BaP與生物膜上的生理敏感位點(diǎn)結(jié)合,并促進(jìn)了BaP的積累,而隨著Cd濃度的增加,Cd與LaCl3對(duì)BaP在生理敏感位點(diǎn)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用顯著增加,逐漸抑制了BaP的積累.

NEM可以特異性地結(jié)合蛋白或含巰基的小分子化合物(如谷胱甘肽),并減少 Cd在 Caco-2細(xì)胞中的積累[35],這表明 Cd進(jìn)入細(xì)胞需要蛋白或含巰基的小分子化合物作為中介[33].本實(shí)驗(yàn)中蚯蚓經(jīng)不同濃度的 NEM 預(yù)暴露后,在單一 BaP污染下,3個(gè)亞細(xì)胞組分中BaP的積累受到促進(jìn),特別是在細(xì)胞碎片組分中(圖3),故BaP的轉(zhuǎn)運(yùn)也可能與巰基蛋白等有關(guān).推測(cè) NEM 能夠與非特異性位點(diǎn)上的巰基等蛋白特異性結(jié)合,使得 BaP從非特異性位點(diǎn)進(jìn)入蚯蚓細(xì)胞的方式減弱,增加了外界液體中BaP的濃度,導(dǎo)致BaP與生物膜上的生理敏感位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn)了BaP的積累.

NEM 處理后的蚯蚓在復(fù)合污染下,細(xì)胞溶質(zhì)組分中BaP的積累受到了顯著的抑制作用(圖4),這可能是因?yàn)榧?xì)胞溶質(zhì)組分的Cd積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于固體顆粒組分和細(xì)胞碎片組分中的Cd積累量[36-37],而高濃度的Cd可以顯著抑制BaP的積累(圖 2),且高濃度作用下,兩者在生理敏感位點(diǎn)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用顯著增加,使得細(xì)胞溶質(zhì)組分中的BaP濃度受到顯著的抑制作用.而固體顆粒組分和細(xì)胞碎片組分中的 BaP濃度分別在 0.2和0.5mg/L Cd作用下受到了顯著的促進(jìn)(圖4),這與單一污染趨勢(shì)一致,可能是因?yàn)榈蜐舛?Cd作用下,NEM與Cd同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)非特異性位點(diǎn)上的巰基等蛋白,減弱了BaP從非特異性位點(diǎn)進(jìn)入蚯蚓細(xì)胞的途徑,增加了體液中BaP濃度,繼而促使BaP與生物膜上的生理敏感位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn)BaP積累.

4 結(jié)論

4.1 BaP主要積累在細(xì)胞碎片組分中,其次為固體顆粒組分和細(xì)胞溶質(zhì)組分.

4.2 單一BaP污染,LaCl3和NEM均不同程度地促進(jìn)3個(gè)亞細(xì)胞組分中BaP的積累.

4.3 Cd和BaP復(fù)合污染下,LaCl3促進(jìn)蚯蚓3個(gè)亞細(xì)胞組分中BaP的積累,NEM促進(jìn)BaP在固體顆粒組分和細(xì)胞碎片組分中的積累,抑制其在細(xì)胞溶質(zhì)組分中的積累.

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