精喹禾靈降解菌株Bacillus subtilis H的分離鑒定及降解特性

侯 穎,李靜泉,尤曉顏,王維宇,裴 韜,孫軍杰 (內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境污染控制與廢物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 000；河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽4703)

精喹禾靈,化學(xué)名稱(R)-2-[4-(6-氯喹喔啉-2-基氧)苯氧基]丙酸乙酯,屬芳氧苯氧丙酸類,內(nèi)吸傳導(dǎo)型選擇性莖葉處理除草劑,其作用機(jī)制是抑制禾本科植物分生組織的細(xì)胞脂肪酸合成[1].隨著精喹禾靈毒理研究的開展,越來越多的報(bào)道顯示,精喹禾靈對植物、動(dòng)物及人類安全產(chǎn)生了嚴(yán)重影響.有研究表明:精喹禾靈對植物具有一定的遺傳毒性和基因毒性[2-3];對動(dòng)物除具有急性毒性以外[4-5],還具有較強(qiáng)的慢性毒性和生殖毒性,如精喹禾靈可引起斑馬魚心臟畸形[5],誘導(dǎo)人淤膽型和肝細(xì)胞混合型的肝損傷[6],對大鼠睪丸生精細(xì)胞具有損傷作用等[7-8].因此,精喹禾靈在加拿大等國家被限定殘留量[9],歐盟甚至禁止其使用[10],但在我國精喹禾靈仍被廣泛生產(chǎn)和使用.

土壤微生物對精喹禾靈在土壤環(huán)境中的降解發(fā)揮著重要作用[11],土壤中微生物越多,精喹禾靈在土壤中降解越快[12],因此利用微生物降解進(jìn)行精喹禾靈污染的環(huán)境修復(fù)成為一種非常有效的手段.近年來,已有多種能夠降解精喹禾靈的微生物菌株從土壤中分離出來,如 Pseudomonas sp. L1[13]、Bacillus pumilis[14]、Rhodococcus sp.J-3[15]、Rhodococcus sp. JT-3[16]和 Ochrobactrum sp. QE-9[17].此外,在關(guān)于其他芳氧苯氧丙酸類除草劑微生物降解的報(bào)道中,菌株 Pseudomonas azotoformans QDZ-1[18]、Rhodococcus sp. T1[19]、Acinetobacter sp. DL-2[20]和Rhodococcus ruber JPL-2[21]等對精喹禾靈也有一定的降解能力.本研究以精喹禾靈為唯一碳源,從長期受精喹禾靈污染的土壤中篩選到 1株精喹禾靈降解菌Bacillus subtilis H,并詳細(xì)研究了該菌株對精喹禾靈的降解特性和降解機(jī)制,這是首次關(guān)于枯草芽孢桿菌降解精喹禾靈的研究.

關(guān)于利用 Bacillus subtilis進(jìn)行環(huán)境污染生物修復(fù)的報(bào)道已有很多,如Bacillus subtilis能夠修復(fù)石油污染[22]、降解農(nóng)藥 DDT[23]等.Bacillus subtilis在土壤中廣泛存在,生長速度快,抗逆性強(qiáng)并可以分泌多種酶,這些特性使其成為修復(fù)環(huán)境污染的理想微生物.提過的精喹禾靈樣品,于常溫常壓下?lián)]發(fā)至干,加入1mL色譜純甲醇溶解剩余物,并用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后利用 HPLC檢測.液相色譜條件:4.6mm×250mm C18反相色譜柱;流動(dòng)相為80%甲醇,流速為 1mL/min,上樣量為 10μL,柱溫為30℃ .Waters 2487紫外檢測器,檢測波長為235nm.

1 材料與方法

1.1 土樣

江蘇省某農(nóng)藥廠長期受精喹禾靈污染的土壤.

1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB 培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 5.0,胰蛋白胨 10.0,NaCl 10.0,pH值自然.

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM,g/L):NH4NO31.0,KH2PO40.5, K2HPO41.5,NaCl 1.0, MgSO4·7H2O 0.1,pH 7.0.

富集培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加 20mg/L酵母汁作為生長因子.

精喹禾靈(94.2%)原藥由安徽華星化工有限公司贈(zèng)送.

1.3 精喹禾靈的檢測及降解產(chǎn)物的鑒定

高效液相色譜(HPLC)檢測:取 5mL培養(yǎng)液,用10%HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值至2.0后,加入等體積二氯甲烷,劇烈震蕩 1min,靜置 10min,去水相,加無水硫酸鈉去除有機(jī)相中殘余水分.取1mL抽

精喹禾靈降解產(chǎn)物的鑒定采用 UPLC-MS.色譜系統(tǒng):Waters ACQUITY UPLC M-Class.色譜柱:Acquity BEH C18(2.1mm×50mm,1.7pm);柱溫30℃;進(jìn)樣量 5μL;流動(dòng)相:乙腈-0.1%甲酸(體積比70:30);流速0.2mL/min.

質(zhì)譜系統(tǒng):Waters XEVO-TQS micro.離子源ESI,毛細(xì)管電壓5.0kV,離子源溫度120℃,脫溶劑氣溫度 500℃,錐孔反吹氣流量 50L/h,脫溶劑氣流量800L/h,錐孔壓力30kV,碰撞能量20eV,檢測器為XDRTM,m/z掃描范圍為50～600,正離子掃描模式.

1.4 精喹禾靈降解菌的富集與分離

在100mL含50mg/L精喹禾靈的富集培養(yǎng)基中加入10g土樣,于30℃,180r/min培養(yǎng)7d.按1.3所述方法測定富集液有降解效果后,吸取 10mL富集液轉(zhuǎn)移至新鮮富集培養(yǎng)基中,連續(xù)富集.待富集液降解效果穩(wěn)定后,采用稀釋平板法,將稀釋后的富集液涂布于含200mg/L精喹禾靈的LB固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48h后,凡是菌落周圍有透明圈的菌株即為要分離的精喹禾靈降解菌.對分離到的菌落形態(tài)不同的精喹禾靈降解菌進(jìn)行劃線純化后,挑取其單菌落接種于含100mg/L精喹禾靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,30℃,180r/min培養(yǎng),24h后取樣測定培養(yǎng)基中精喹禾靈的殘留量,選取降解效果最好的菌株H作為進(jìn)一步研究對象.

1.5 菌株H的初步鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[24]對菌株H進(jìn)行菌落、菌體形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn).

菌株 16S rRNA基因序列分析:采用菌落PCR技術(shù)擴(kuò)增降解菌株16S rRNA基因序列.引物為細(xì)菌 16S rRNA 基因通用引物 27f:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Escherichia coli bases 8to 27)和 1492r:5’-TACCTTGTTAC-GACTT-3’(Escherichia coli bases 1507to 1492).擴(kuò)增反應(yīng)體系:10×TaqDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5μL,dNTP(20mmol/μL) 4μL,引物(25pmol/μL)各2μL,Mg2+(25mmol/μL) 4μL,菌體少量,TaqDNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL,加滅菌雙蒸水至 50μL;反應(yīng)條件:95℃變性 5min,95 ℃ 30s,55 ℃ 30s,72℃1.5min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物經(jīng) 0.75%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序.將測定的菌株16S rDNA序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線比對分析,并在 Ribosomal Database Project(RDP)數(shù)據(jù)庫中下載與降解菌株16S rRNA基因序列同源的序列,最后,采用 MEGA6.0軟件構(gòu)建降解菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.6 菌株H對精喹禾靈的降解

將菌株H在液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)12h后,5000r/min離心5min收集菌體,用滅菌的 MSM 培養(yǎng)基洗滌一次后,制成 OD600nm=1.0的種子液.將種子液按 5%接種量接種到含100mg/L精喹禾靈的MSM中,于37℃、180r/min搖床培養(yǎng),每隔24h取樣一次,利用HPLC測定培養(yǎng)液中精喹禾靈的含量,同時(shí)采用稀釋平板法測定培養(yǎng)液中菌株 H的數(shù)量,確定菌株H對精喹禾靈的降解能力及利用精喹禾靈的生長情況.另外,在不同溫度(20、25、30、37、42℃)、不同初始 pH 值(5、6、7、8、9、10)、不同精喹禾靈初始濃度(25、50、100、200mg/L)、不同接種量(0.5%、1%、5%和10%)以及添加各種金屬離子(0.5mmol/L)條件下測定菌株H對精喹禾靈的降解特性.

2 結(jié)果與討論

2.1 精喹禾靈降解菌的分離與鑒定

利用以精喹禾靈為唯一碳源的富集培養(yǎng)基,從采集的土樣中分離到一株精喹禾靈降解菌,命名為菌株 H.該菌株在含精喹禾靈的 LB固體培養(yǎng)基上能形成明顯的水解圈(圖 1a),其菌落呈污白色,扁平,不透明,邊緣不整齊(圖 1a).對其菌體進(jìn)行簡單染色后,在顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)其菌體為長桿狀,有芽孢,無莢膜(圖1b).生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明:菌株H的接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、酯酶試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)均為陽性,V-P試驗(yàn)為陰性.

利用細(xì)菌 16S rRNA基因通用引物 27f和1492r對菌株H的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序后,將其基因序列提交GenBank,獲得其登錄號(hào)為MF574323.通過BLAST比對,表明菌株H的16S rRNA基因與Bacillus subtilis strain Bs_TC6的16S rRNA基因(登錄號(hào):KY575578)相似度最高,達(dá)到 100%.利用 RDP數(shù)據(jù)庫的Sequence Match分析和MEGA 6.0構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖2所示.結(jié)果表明:菌株H與枯草芽孢桿菌模式菌株DSM10(登陸號(hào):AJ276351)位于同一分支,說明二者親緣關(guān)系最近.綜合菌株H的形態(tài)特征、生理生化特性,將菌株H確定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis).2.2 菌株H以精喹禾靈為唯一碳源的降解曲線及降解產(chǎn)物鑒定

圖1 菌株H菌落與菌體形態(tài)(1000×)Fig.1 Morphology of colony and cell of strain H (1000×)

將菌株 H種子液按 5%接種量接種到含100mg/L精喹禾靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中后,定時(shí)取樣測定精喹禾靈的濃度,并在接種0h和96h利用平板菌落計(jì)數(shù)法測定培養(yǎng)基中活菌數(shù)量,結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出,菌株H具有很強(qiáng)的降解精喹禾靈的能力,在24h即可將100mg/L精喹禾靈降解 70%左右,之后降解速度開始降低,72h以后即可將 100mg/L的精喹禾靈降解 98.94%.菌株 H對精喹禾靈的降解動(dòng)力學(xué)方程為y=111.0868e-0.0505x(r=0.9436,P<0.05).與已報(bào)道的其他種屬細(xì)菌相比,枯草芽孢桿菌H的降解能力較強(qiáng),如已報(bào)道的Pseudomonas屬細(xì)菌需要4～9d才能將 50mg/L的精喹禾靈降解 90%以上[11].此外枯草芽孢桿菌還具有生長速度快、易培養(yǎng)、對環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、對人畜安全等特點(diǎn),使其在環(huán)境污染物的生物處理和修復(fù)中更具有優(yōu)勢.枯草芽孢桿菌平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果表明,在接種0h和96h后培養(yǎng)液中菌株H的活菌細(xì)胞數(shù)分別為4.5×107和3.7×108cfu/mL,這說明菌株H能以精喹禾靈為唯一碳源進(jìn)行生長.

圖2 菌株H的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain H

圖3 菌株H對精喹禾靈的降解曲線Fig.3 Degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

利用HPLC分析發(fā)現(xiàn),未接種菌株H的對照培養(yǎng)基中僅有一個(gè)精喹禾靈的特征峰,其保留時(shí)間為13.365min(圖4a);而在接種菌株H的培養(yǎng)基中除了有精喹禾靈的特征峰外,還有一個(gè)特征峰,其保留時(shí)間為 3.678min,并且其濃度隨著精喹禾靈濃度的降低而升高,推測其為精喹禾靈的代謝產(chǎn)物(圖4b).收集該產(chǎn)物,對其進(jìn)行UPLC-MS鑒定,發(fā)現(xiàn)其 m/z=345,并且該物質(zhì)可產(chǎn)生m/z=91、121、272和299的碎片離子(圖4d),結(jié)合精喹禾靈的 UPLC-MS圖譜和碎片離子情況(圖 4c),推測該代謝產(chǎn)物為精喹禾靈酸.進(jìn)一步研究表明,菌株H不能降解精喹禾靈酸,即菌株H是通過斷裂精喹禾靈分子中丙酸和乙醇之間的酯鍵使其降解的,這與菌株H酯酶試驗(yàn)為陽性相吻合.關(guān)于微生物降解芳氧苯氧丙酸類除草劑的報(bào)道中,大多數(shù)菌株是通過分泌酯酶使除草劑酯鍵斷裂形成相應(yīng)的酸[17-21];而此類除草劑完全礦化往往需要多種微生物的共同作用[16,25],因此還需進(jìn)一步分離和篩選完全降解精喹禾靈的菌株.

圖4 精喹禾靈及其降解產(chǎn)物的高效液相色譜和質(zhì)譜Fig.4 High performance liquid chromatography and mass spectrometry of quizalofop-p-ethyl and its degradation product

2.3 溫度和初始pH值對菌株H降解精喹禾靈的影響

圖5 溫度對菌株H降解精喹禾靈的影響Fig.5 Effect of temperature on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

溫度和 pH值不僅是影響微生物生長的重要環(huán)境因素,也是影響微生物降解污染物酶促反應(yīng)的重要環(huán)境條件.溫度對菌株 H降解精喹禾靈的影響結(jié)果如圖5所示,菌株H在30～42℃范圍內(nèi)對精喹禾靈的降解率均達(dá)到 95%以上,而當(dāng)溫度范圍在20～25℃范圍內(nèi)時(shí),菌株H對精喹禾靈的降解能力較低,但72h時(shí)仍然可以達(dá)到80%以上的降解率.出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是菌株 H為芽孢菌,無論是其菌體還是其產(chǎn)生的降解酶都比較耐熱,所以即使在 42℃時(shí)仍然有很高的降解能力.而當(dāng)溫度處在20～25℃范圍內(nèi),菌株 H的生長和酶促反應(yīng)反而受到一定的抑制.pH值對菌株H降解精喹禾靈的影響如圖6所示,菌株H在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)對精喹禾靈的降解效果沒有太大的變化,其降解率均在 90%以上,說明菌株 H可以適應(yīng)大多數(shù)自然環(huán)境下的酸堿度而發(fā)揮降解功能.

圖6 初始pH值對菌株H降解精喹禾靈的影響Fig.6 Effect of initial pH value on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

2.4 精喹禾靈初始濃度對菌株H降解能力的影響

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入初始濃度為25、50、100、200mg/L的精喹禾靈,按5%接種量接入菌株H種子液,定時(shí)取樣,測定菌株H在不同底物濃度下的降解能力,結(jié)果如圖7所示.由圖7可以看出,雖然隨著底物濃度的升高,精喹禾靈所需要的降解時(shí)間不斷延長,但對菌株 H總的降解能力影響不大,即使精喹禾靈初始濃度為 200mg/L,其在72h內(nèi)的降解率仍然達(dá)90%以上,這說明菌株H對高濃度的精喹禾靈有較強(qiáng)的耐受力.

圖7 精喹禾靈初始濃度對菌株H降解能力的影響Fig.7 Effect of initial quizalofop-p-ethyl concentration on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

2.5 接種量對菌株H降解精喹禾靈的影響

在含有 100mg/L精喹禾靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,分別接入0.5%、1%、5%和10%的菌株H 種子液,然后定時(shí)取樣,測定精喹禾靈在不同接種量條件下的降解情況.結(jié)果如圖8所示,接種量對精喹禾靈的降解速率有較大影響,隨著接種量的增加,精喹禾靈的降解速率明顯增大;但即使在接種量較低時(shí)(0.5%和1%),72h內(nèi)精喹禾靈的降解率仍然達(dá)98%以上,該結(jié)果進(jìn)一步表明菌株H對精喹禾靈有很強(qiáng)的降解能力.

圖8 接種量對菌株H降解精喹禾靈的影響Fig.8 Effect of inoculum size on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

2.6 金屬離子對菌株H降解精喹禾靈的影響

圖9 金屬離子對菌株H降解精喹禾靈的影響Fig.9 Effect of metal ions on degradation of quizalofop-p-ethyl by strain H

菌株 H主要是利用其產(chǎn)生的酶對精喹禾靈進(jìn)行降解,很多金屬離子對酶的活性有影響,因此,對常見金屬離子對菌株 H降解精喹禾靈的影響進(jìn)行了研究.由圖9可以看出,Co2+對菌株H降解精喹禾靈有強(qiáng)烈的抑制作用,在其影響下菌株 H在72h內(nèi)對精喹禾靈的降解率僅有20%,其原因可能是Co2+對菌株H的生長以及其產(chǎn)生的酶有強(qiáng)烈的抑制作用.其次Mn2+對菌株H降解精喹禾靈有輕微抑制作用,而其它金屬離子對菌株H降解精喹禾靈的促進(jìn)和抑制作用均不明顯.

3 結(jié)論

3.1 從采集的土樣中分離出一株精喹禾靈高效降解菌株H,經(jīng)生理生化和16S rRNA基因序列分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis).

3.2 菌株 H 能以精喹禾靈為唯一碳源生長,在37℃,pH8.0條件下,72h內(nèi)可將100mg/L的精喹禾靈降解98%.

3.3 菌株 H 在溫度為 30～42℃和 pH6～10范圍內(nèi)均可有效降解精喹禾靈;在精喹禾靈濃度≤200mg/L時(shí),其濃度對菌株 H的降解能力影響不大;菌株H降解能力較強(qiáng),即使低接種量(0.5%)仍然可以很好的降解精喹禾靈.

3.4 Co2+對菌株H降解精喹禾靈有明顯的抑制作用,Mn2+對菌株H降解精喹禾靈有輕微抑制作用.

3.5 菌株H降解精喹禾靈的產(chǎn)物為精喹禾靈酸,即菌株 H降解精喹禾靈的機(jī)制是其分泌酯酶使精喹禾靈分子中丙酸和乙醇之間的酯鍵斷裂.

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