紅球菌BAP-1對熒蒽的跨膜運輸過程

李 藝,王紅旗,吳梟雄,許 潔 (1.廣西師范大學環(huán)境與資源學院,廣西 桂林 541004；.北京師范大學水科學研究院,北京 100875)

多環(huán)芳烴包括一系列潛在的環(huán)境污染物,這些污染物通常具有“三致”效應,是一類典型的持久性有機污染物[1-2].能夠降解多環(huán)芳烴的微生物有很多種,包括細菌、真菌和藻類.這些微生物通過攝取運輸和生物轉化過程,將高疏水性的多環(huán)芳烴分解成為較為簡單代謝產物,然后通過礦化作用,將這些簡單的代謝產物轉化成無機物質,如 H2O和 CO2(好氧生物降解)或者CH4(厭氧生物降解)[3].紅球菌是一種典型的多環(huán)芳烴降解菌,可以有效的降解萘、菲、熒蒽等多環(huán)芳烴[4-5].在加入非離子表面活性劑如Tween 80后,能夠有效的促進紅球菌分泌表面活性劑,使處理效果得到顯著的提高[6].同時,紅球菌在高酸堿性、高鹽度及低溫的條件下,依然可以有較好的降解效果[7].

由于多環(huán)芳烴具有高毒性,因此在低濃度下就能對其降解微生物造成毒性效應;另外由于多環(huán)芳烴本身的高疏水性和低生物利用性,要通過一些特殊的機制和反應,微生物才能與多環(huán)芳烴進行充分的接觸,吸附并且代謝,從而達到更好的處理效果[8-10].在微生物成功的對多環(huán)芳烴進行吸附攝取后,多環(huán)芳烴需要通過微生物的細胞膜跨膜運輸進入到細胞體內.此時,微生物才能對多環(huán)芳烴進行降解.然而,細胞為了完成特定的生理功能,必須與周圍的環(huán)境發(fā)生信息,物質和能量的交換,因此,細胞必須具備一套物質轉運體系,用來獲取所需的物質和排泄代謝廢物.Bateman等[11]的研究表明菌株Pseudomonas putida PpG1064對萘的運輸過程與底物濃度無關,是不需要能量的簡單擴散過程;而Beal等[10]的研究表明,人為添加ATP抑制劑 CCCP(間苯腙氯羰氰,carbonyl cyanide m-chlorophenyhydrazone)和 DNP(2,4-二硝基酚,2,4-dinitrophenol),嚴重阻礙了菌株 Pseudomonas aeruginosa對正十烷的攝取,這說明菌株對正十烷的攝取過程是需要能量的主動運輸.Bugg等[12]的研究表明,菌株Pseudomonas fluorescens LP6a從環(huán)境中攝取多環(huán)芳烴時,所采取的運輸方式是被動擴散;而當其將多環(huán)芳烴從體內釋放時,則是通過需要能量的主動運輸方式來實現(xiàn).這些研究表明,在跨膜運輸過程中,有些機制有可能單一起作用也有可能綜合作用于反應過程.

然而,對多環(huán)芳烴跨膜運輸?shù)难芯恐饕性趯梁头频难芯?對中高環(huán)芳烴的跨膜運輸方式的研究較少,同時對微生物跨膜運輸多環(huán)芳烴過程中的關鍵環(huán)節(jié)和控速步驟都尚不明確.基于此,本研究利用同位素示蹤法,以紅球菌 BAP-1作為靶微生物,分析在不同底物條件以及有無能量抑制劑存在的情況下,紅球菌BAP-1對熒蒽的跨膜運輸規(guī)律.并且結合米氏方程,對紅球菌BAP-1跨膜運輸熒蒽的動力學過程進行探討.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗過程使用的主要化學藥品及來源:熒蒽(分析純,日本 TCI公司);14C-熒蒽(99%純,美國ChemDeop 實驗室);丙酮,乙腈,甲醇,正己烷(色譜純,美國J.T.Baker公司);NaCl, Na2HPO4, KH2PO4,NH4Cl, MgSO4·7H2O 、 CaCl2, FeSO4·7H2O,NaNO3,牛肉膏等(分析純,北京試劑公司);蛋白胨(分析純,北京鼎國生物試劑公司);酵母粉(分析純,OXOID公司).

本研究以課題組前期研究所篩選出的高效多環(huán)芳烴降解菌––紅球菌BAP-1作為研究靶細胞,GenBank登錄號:JX683682; 中國科學院微生物所菌株保藏號7.68[13].

1.2 培養(yǎng)基及相關溶液的配制

無機鹽培養(yǎng)基(MSM):4g Na2HPO4, 1.5g KH2PO4, 1g NH4Cl, 0.2g MgSO4·7H2O, 0.02g CaCl2, 0.03g FeSO4·7H2O, 1.0g NaNO3, 1mL 微量元素/L培養(yǎng)基(每 100mL溶液包括:0.25mg CoCl2·6H2O, 0.37mg (NH4)6Mo7O24·4H2O, 4.0mg CuSO4·5H2O, 5.7mg H3BO3, 4.3mg MnSO4·5H2O,4.3mg ZnSO4·7H2O),去離子水定容到 1000mL,121℃高壓蒸汽滅菌20min.

LB培養(yǎng)基:5g牛肉膏,10g蛋白胨,5g NaCl,去離子定容到 1000mL, 121℃高壓蒸汽滅菌20min.選擇性無機培養(yǎng)基:將無機鹽培養(yǎng)基置于121℃下高壓滅菌 20min,在無菌條件下,加入一定量含熒蒽的丙酮溶液,使其達到預定濃度,置于搖床上振蕩 24h,待丙酮揮發(fā)后使用.磷酸鹽緩沖溶液(PBS):0.87g K2HPO4, 0.68g KH2PO4, 8.77g NaCl,去離子水定容到1000mL, pH=6.8.

熒蒽儲備液:用電子天平準確稱量1.0g熒蒽,用丙酮溶液定容至 1L,濃度為 1000mg/L.14C-熒蒽儲備液:實驗用的14C-熒蒽初始濃度為50mCi/mmol(0.1mCi/mL),溶劑為甲醇.通過稀釋再配置濃度為 25μCi/mL (0.5μmol/mL)和 0.25μCi/mL(0.005μmol/mL)的14C-熒蒽溶液待用.

1.3 實驗方法

1.3.114C-熒蒽的取樣分析方法 用玻璃注射器吸取1mL的發(fā)酵液直接加入到閃爍液中分析發(fā)酵液中殘留的14C-熒蒽含量.用玻璃注射器吸取1mL的發(fā)酵液,用0.2μm的 Whatman聚碳酸酯濾膜過濾收集菌體,并用滅菌磷酸緩沖液(PBS)清洗 6次后,將濾膜取出加入到閃爍液中分析紅球菌BAP-1膜結合14C-熒蒽的含量,實驗平行樣3個.胞外14C-熒蒽含量(μmol/L)=發(fā)酵液中總14C-熒蒽含量-膜結合14C-熒蒽含量;14C-熒蒽的降解率(%)=1-發(fā)酵液中殘留的14C-熒蒽含量/發(fā)酵液初始14C-熒蒽含量. 其中,14C-熒蒽的放射量采用TR-2900液體閃爍儀(美國Packard)進行分析.

1.3.2 生物降解過程中14C-熒蒽在細胞膜內外的含量分配 實驗在150mL的三角瓶中進行,在60mL的滅菌MSM培養(yǎng)基中加入MSM重懸的 BAP-1菌體,控制初始 OD600值為 0.5,控制14C-熒蒽的初始濃度為0.25μmol/L;同時在另一組實驗中加入 NaN3,控制 NaN3的濃度為30mmol/L.對照組不添加紅球菌 BAP-1,僅加入14C-熒蒽以分析其非生物損失量,分別在 1, 5,10, 30min, 1, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96h取樣分析膜結合14C-熒蒽的含量和發(fā)酵液中殘留的14C-熒蒽含量.

1.3.3 不同熒蒽濃度下紅球菌BAP-1對14C-熒蒽跨膜運輸規(guī)律 實驗在100mL的三角瓶中進行,在15mL的滅菌MSM培養(yǎng)基中加入MSM重懸的BAP-1菌體,控制初始OD600值為0.2,之后加入甲醇溶解的14C-熒蒽.分別從 25μCi/mL的14C-熒蒽儲備液中移取 0.6, 1.2, 4.8, 9.6, 28.8,60mL溶液加入到15mL MSM培養(yǎng)基中,此時培養(yǎng)基中14C-熒蒽的初始濃度分別為 0.20, 0.40,1.60, 3.20, 9.60, 20.00μmol/L.在 1, 3, 5, 10, 12, 15,18和20min取樣,分析細胞膜內跨膜攝取14C-熒蒽的量.

1.3.4 不同接菌量條件下紅球菌BAP-1對14C-熒蒽跨膜運輸規(guī)律 實驗在100mL的三角瓶中進行,控制14C-熒蒽的初始濃度為0.40μmol/L(即從 0.25μCi/mL的儲備液中移取 1.2mL加至15mLMSM培養(yǎng)基中).在15mL的滅菌MSM培養(yǎng)基中加入MSM重懸的BAP-1菌體,控制初始OD600值分別為0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1.0, 1.5和2.0.在1和20min取樣,分析細胞膜內跨膜攝取14C-熒蒽的量.

1.3.5 紅球菌BAP-1體內包涵體形態(tài)的變化觀察 以在含有5和150mg/L熒蒽的MSM培養(yǎng)基中生長 168h的紅球菌BAP-1菌體及同時含有30mmol/L NaN3和5mg/L熒蒽的MSM培養(yǎng)基中生長168h的紅球菌BAP-1作為觀察對象,利用透射電鏡(JEM-1400,日本電子 JEDL)對紅球菌BAP-1體內包涵體的形態(tài)變化進行觀察,從微觀角度分析紅球菌BAP-1對熒蒽的跨膜運輸過程.透射電鏡的前處理方法:在 4500r/min的條件下(10min, 4℃)離心收集菌體,在收集的菌體中加入磷酸緩沖戊二醛溶液約1～2mL靜置3h對菌體進行固定.3h后離心,加入磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)吹打使細胞重懸,靜置 15min離心,重復 3次;加入1%俄酸固定2h,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗6次,每次 15min;然后依次用 30%, 50%, 70%, 80%,90%酒精-水溶液洗滌細胞,每次靜置15min后離心,濃度依次遞增,最后用 100%乙醇洗滌細胞 3次,每次15min.將處理好的樣品用EPON812樹脂包埋劑進行包埋,包埋后對聚合好的包埋塊進行修塊、切片及染色,最后用透射電鏡觀察菌體內部包涵體形態(tài)的變化.

1.3.6 米氏方程結合同位素示蹤法分析紅球菌跨膜運輸熒蒽的動力學過程 實驗在 50mL的三角瓶中進行,在15mL的滅菌MSM培養(yǎng)基中加入MSM重懸的BAP-1菌體,控制初始OD600值為 0.2.之后加入甲醇溶解的14C-熒蒽,分別從25μCi/mL的14C-熒蒽儲備液中移取0.6, 1.2, 4.8,9.6, 28.8, 60mL溶液加入到15mLMSM培養(yǎng)基中,此時培養(yǎng)基中14C-熒蒽的初始濃度分別為0.20,0.40, 1.60, 3.20, 9.60, 20.00μmol/L. 1, 3和 5min內取樣分析膜結合14C-熒蒽的量,實驗結果(14C-熒蒽的濃度)用 μmol/L表示.跨膜運輸動力學方程:V=Vmax·S/(Kt+S).其中:V 表示14C-熒蒽的膜結合速率,μmol/(L·min);Vmax表示紅球菌 BAP-1 對14C-熒蒽的最大攝取速率;Kt表示攝取速率達到最大速率一半時的底物濃度,μmol/L;S表示初始14C-熒蒽的濃度,μmol/L.

1.4 數(shù)據(jù)處理

文中所有實驗數(shù)據(jù)的測定重復 3次,實驗數(shù)據(jù)的方差分析采用 SPSS 19.0軟件完成,數(shù)據(jù)的表達方式為:平均數(shù)±標準偏差;圖像繪制采用Excel 2010軟件完成.

2 結果與討論

2.114C-熒蒽在紅球菌BAP-1細胞膜內外的含量分配研究

控制14C-熒蒽的初始濃度為 0.25μmol/L,如圖 1(a)所示,在 1min時對第一個樣品進行分析,發(fā)現(xiàn)紅球菌BAP-1細胞膜內所結合的14C-熒蒽的含量為(0.0531±0.0084)μmol/L,占總14C含量的21.24%,而此時細胞膜外的14C-熒蒽的含量為0.1969±0.0075μmol/L.從圖中可以看出,在反應開始的1h內,紅球菌BAP-1膜內所結合的14C-熒蒽的含量緩慢增加,在 1h時達到最高的(0.0962±0.0159)μmol/L,占總14C 含量的 38.4%.隨著反應的繼續(xù),在培養(yǎng) 24h后,發(fā)現(xiàn)紅球菌BAP-1膜結合14C-熒蒽的含量降低至(0.0506±0.0048)μmol/L,培養(yǎng) 48h 后繼續(xù)降低至(0.0345±0.0176)μmol/L,之后保持穩(wěn)定.這一過程說明在紅球菌 BAP-1對14C-熒蒽的跨膜運輸過程中,目標物質首先與微生物相接觸從而進入到微生物體內.這時微生物開始對目標污染物進行降解,隨著降解過程的進行,膜結合14C-熒蒽的量逐漸減少,最后達到穩(wěn)定.

然而,如圖 1(b)在有 NaN3的存在下,從反應開始紅球菌BAP-1細胞膜內所結合的14C-熒蒽含量幾乎不變.即 NaN3的存在抑制了紅球菌BAP-1對14C-熒蒽跨膜運輸,從而使得微生物對底物無降解作用.在反應進行了96h之后,紅球菌BAP-1細胞膜內所結合的14C-熒蒽的含量為(0.0095±0.0041)μmol/L,細胞外14C-熒蒽含量為(0.2405±0.0027)μmol/L. NaN3的存在阻斷了電子鏈的傳遞同時也消除了跨膜的H+電勢,造成了菌體的死亡,也抑制了菌體對底物的攝取.

Kallimanis等[14]的研究表明,在 NaN3和DNP的存在下,微生物 Arthrobacter sp. strain Sphe3細胞膜內依然可以富集發(fā)酵液中的菲,表明微生物是以被動運輸?shù)姆绞綄Ψ七M行攝取.Miyata等[15]的研究則表明,在CCCP和KCN的存在下,微生物 Mycobacterium sp. strain RJGII-135細胞膜內富集菲的含量降低,表明微生物是以主動運輸?shù)姆绞綄Ψ七M行攝取.從本文的研究結果可以看出,NaN3的存在抑制了紅球菌 BAP-1對14C-熒蒽跨膜運輸,表明紅球菌BAP-1對熒蒽的跨膜運輸過程是需要能量的主動運輸過程,熒蒽是需要在紅球菌 BAP-1的內部進行降解的,如果跨膜運輸過程無法進行,熒蒽將無法得到有效的降解.

圖1 紅球菌BAP-1膜內外14C-熒蒽的含量分布Fig.1 Content of 14C-fluoranthene in the Rhodococcus sp.BAP-1 during the trans-membrane process

2.2 不同初始濃度下14C-熒蒽的跨膜運輸規(guī)律

從圖 2中可以看出,在底物初始濃度分別0.2,0.4,1.6,3.2,9.6和20.0μmol/L時,紅球菌BAP-1對熒蒽的膜結合量在反應進行 1min時為(0.0531±0.0084)μmol/L,(0.0691±0.0075)μmol/L,(0.0992±0.0054)μmol/L,(0.1113±0.0115)μmol/L,(0.2728±0.0174)μmol/L和(0.3607±0.0157)μmol/L.在反應進行 10min時基本達到了飽和,此時的膜結合14C-熒蒽量分別達到了(0.0827± 0.0067)μmol/L,(0.1384±0.0166)μmol/L, (0.1607± 0.0057)μmol/L,(0.1749±0.0256)μmol/L, (0.3859± 0.0018)μmol/L 和(0.5142±0.0086)μmol/L;占發(fā)酵液中總14C-熒蒽量的比例為41.35%, 40.18%, 10%, 5.3%,4.1%和2.5%.

研究結果表明隨著底物濃度增加,紅球菌BAP-1對14C-熒蒽的攝取比例并沒有隨之線性增加,而是隨著底物濃度的增加而降低,而且膜結合14C-熒蒽的量始終低于膜外14C-熒蒽的量;同時,可以看出在底物濃度相對較高時,如9.6μmol/L,微生物細胞對14C-熒蒽的攝取量在緩慢增加后有一個下降趨勢,這也與之前研究發(fā)現(xiàn)的微生物自身具有自我保護機制,當有毒物質的濃度過大時,微生物將其排出體外以保持微生物體內外環(huán)境的相對平衡的結論相似[16].從圖 2還可以看出,無論在何種濃度條件下,紅球菌BAP-1的體外14C-熒蒽濃度均高于體內的濃度,膜結合14C-熒蒽的量并不隨著底物濃度的增加而增加.之前我們的研究表明紅球菌BAP-1對14C-熒蒽的跨膜運輸過程是需要能量的主動運輸過程[13].這里所得到的研究結論又證明了這一點,因為如果紅球菌 BAP-1對14C-熒蒽的運輸過程是被動運輸,那么其對14C-熒蒽的膜結合量應該隨著底物濃度的增加而梯度增加,然而實驗所得到的結論卻是非線性增加的過程.因此,在不同的底物濃度條件下,紅球菌BAP-1對14C-熒蒽的跨膜運輸過程是需要能量的主動運輸過程.

2.3 不同接菌量下14C-熒蒽的跨膜運輸規(guī)律

從圖 3中可以看出,隨著菌體 OD600值的增加,膜結合14C-熒蒽的量并沒有隨之對應增加.當菌體密度的初始值分別為0.1, 0.2, 0.5, 0.8時,隨著菌體密度的增加,膜結合14C-熒蒽的量也隨著增加,在 20min 時達到(0.1019±0.0087)μmol/L,(0.1330±0.0103)μmol/L, (0.1855±0.0124)μmol/L,(0.2661±0.0134)μmol/L;而當菌體密度的初始值繼續(xù)增加,膜結合14C-熒蒽的量并沒有隨著增加,20min膜結合14C-熒蒽的量保持在(0.2647±0.0029)μmol/L 左右.

圖3 不同接菌量下紅球菌BAP-1對14C-熒蒽的跨膜運輸規(guī)律Fig.3 Uptake of 14C-fluoranthene by Rhodococcus sp.BAP-1 in the different inoculum level

研究表明,紅球菌BAP-1對14C-熒蒽的跨膜運輸與底物濃度的變化有關,也與環(huán)境中菌體的量有關.但是,在一定的底物濃度條件下,并不是環(huán)境中微生物的含量越大就越有利于跨膜運輸過程的進行,菌體膜結合污染物的量會在一定的條件下達到飽和.

2.4 紅球菌BAP-1細胞膜內包涵體的觀察

紅球菌 BAP-1在含有濃度 5mg/L和150mg/L熒蒽的MSM培養(yǎng)基中生長168h,通過透射電鏡對微生物體內包涵體的形態(tài)進行觀察,結果如圖 4所示.可以看出,當培養(yǎng)基中熒蒽的濃度較低時(5mg/L),紅球菌BAP-1中含有透明的包涵體如圖 4(b);而且從放大倍數(shù)為 5000倍的圖4(a)中可以看出,基本上所有的菌體內部都具有或多或少的包涵體;而當培養(yǎng)基中熒蒽的濃度較高時(150mg/L),將菌體放大至 20000倍的圖4(c)中,無法觀察到白色透明的包涵體存在;而當培養(yǎng)基中含有ATP抑制劑NaN3時,將菌體放大至20000倍的圖4(d)中,無法觀察到白色透明的包涵體存在.

圖4 透射電鏡觀察在熒蒽中生長的紅球菌BAP-1形態(tài)變化Fig.4 Transmission Electron Microscopy of Rhodococcus sp. BAP-1 grown on fluoranthene

研究表明,微生物體內包涵體的組成與微生物生長過程中所利用的碳源情況有關[17].Kennedy 和 Finnerty[18]對 Acinetobacter sp.體內的包涵體研究表明,包涵體的組分包括碳鏈長度從 C12到 C20的烴類物質.在我們的前期研究中,發(fā)現(xiàn)Pseudomonas sp. DG17在攝取正十八烷的過程中,微生物體內觀察到有包涵體的存在,而當有NaN3的存在時,菌體死亡,細胞內物質流出,沒有觀察到包涵體[16].另外,結合之前的研究可以發(fā)現(xiàn)[19],當培養(yǎng)基中熒蒽的濃度較低時,熒蒽可以通過細胞膜進入到紅球菌體內,因此紅球菌對熒蒽的降解效果較好;而當熒蒽濃度較高時,由于菌體自身的保護作用,未在微生物體內觀察到包涵體的存在,幾乎沒有熒蒽通過細胞膜進入紅球菌體內,因此紅球菌對熒蒽的降解效果較差.

同時,結合2.1中ATP抑制劑對熒蒽跨膜運輸過程的抑制分析可以看出,紅球菌BAP-1對熒蒽的跨膜運輸過程是需要能量的主動運輸過程,當有 NaN3這類 ATP抑制劑存在的情況下,熒蒽無法通過微生物細胞膜進入到微生物的體內,因此也無法得到較好的降解.所以,跨膜運輸是紅球菌BAP-1降解熒蒽的一個重要步驟,若是熒蒽無法通過紅球菌細胞膜進入到紅球菌細胞體內,就不能得到較好的生物降解.

2.5 紅球菌 BAP-1對熒蒽的跨膜運輸過程動力學分析

圖5 紅球菌BAP-1對14C-熒蒽的跨膜運輸過程動力學分析Fig.5 Analyze of trans-membrane transport kinetics of 14C-fluoranthene by Rhodococcus sp. BAP-1

紅球菌BAP-1對熒蒽的跨膜運輸動力學過程分析如圖5所示.培養(yǎng)基中的14C-熒蒽濃度依次從0.2～20μmol/L,實驗進行1, 3和5min時取樣分析膜結合14C-熒蒽的量.根據(jù)米氏方程的雙倒數(shù)方程所算得的參數(shù)見表 1.從實驗結果可以看出,在各濃度梯度下,反應時間為1, 3和5min時的最大攝取速率 Vmax依次為:0.367, 0.151和0.077μmol/(L·min).可以看出,在各濃度梯度下,紅球菌 BAP-1對14C-熒蒽的跨膜運輸在開始的1min內攝取速率較快,在接下來的反應時間內,攝取速率下降明顯.

從表1中可以看出,在3min的反應時間內,Kt的值基本保持不變,當反應進行到 5min時,Kt的值有所下降,但總體變化不大.研究表明 Kt的值與底物濃度的變化是無關的,它表征的是底物與酶之間的親和力大小[20];Kt的值越小,表示底物與酶之間的親和力越大.可以說,在 5min的實驗過程中,底物14C-熒蒽與紅球菌BAP-1一直保持較高的親和力,紅球菌BAP-1通過主動運輸?shù)姆绞綄?4C-熒蒽進行跨膜運輸,較高的親和力有助于跨膜運輸過程的順利進行.

表1 紅球菌BAP-1對14C-熒蒽跨膜運輸動力學Michaelis-Menten方程參數(shù)Table 1 Michaelis-Menten parameters for the trans-membrane of 14C-fluoranthene by Rhodococcus sp. BAP-1

3 結論

3.1 紅球菌BAP-1在對14C-熒蒽的跨膜運輸過程中,目標物質首先與微生物相接觸從而進入到微生物體內,在有ATP抑制劑NaN3的存在下,從反應開始紅球菌BAP-1細胞膜內所結合的14C-熒蒽含量幾乎沒有變化.

3.2 對微生物體內包涵體的觀察結果表明,當有 NaN3這類抑制劑存在的情況下,熒蒽無法通過細胞膜進入到微生物的體內;說明跨膜運輸是紅球菌降解熒蒽的一個重要步驟,若熒蒽無法進入到紅球菌細胞內,就不能得到有效的生物降解.

3.3 在不同的底物濃度條件下,紅球菌 BAP-1對14C-熒蒽的跨膜運輸過程是需要能量的主動運輸過程;在一定的底物濃度條件下,當菌體密度的初始值持續(xù)增加時,膜結合14C-熒蒽的量并沒有隨著增加,20min膜結合14C-熒蒽的量保持在(0.2647±0.0029)μmol/L 左右,菌體膜結合污染物的量會在一定的條件下達到飽和.

3.4 對紅球菌BAP-1跨膜運輸14C-熒蒽的動力學過程研究表明,底物14C-熒蒽與紅球菌BAP-1一直保持較高的親和力,紅球菌BAP-1通過主動運輸?shù)姆绞綄?4C-熒蒽進行跨膜運輸,較高的親和力有助于跨膜運輸過程的順利進行.

參考文獻：

[1]Hua F, Wang H. Uptake modes of octadecane by Pseudomonas sp.DG17 and synthesis of biosurfactant [J]. Journal of Applied Microbiology, 2012,112(1):25-37.

[2]Fernando Bautista L, Sanz R, Carmen Molina M, et al. Effect of different non-ionic surfactants on the biodegradation of PAHs by diverse aerobic bacteria [J]. International Biodeterioration &Biodegradation, 2009,63(7):913-922.

[3]Haritash A K, Kaushik C P. Biodegradation aspects of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs): A review [J]. Journal of Hazardous Materials, 2009,169(1-3):1-15.

[4]Song X, Xu Y, Li G, et al. Isolation, characterization of Rhodococcus sp. P14capable of degrading high-molecularweight polycyclic aromatic hydrocarbons and aliphatic hydrocarbons [J]. Marine Pollution Bulletin, 2011,62(10):2122-2128.

[5]刁 碩,王紅旗,許 潔,等.低溫耐鹽芘降解菌的篩選鑒定及降解特性研究 [J]. 中國環(huán)境科學, 2017,37(2):677-685.

[6]Kolomytseva M P, Randazzo D, Baskunov B P, et al. Role of surfactants in optimizing fluorene assimilation and intermediate formation by Rhodococcus rhodochrous VKM B-2469 [J].Bioresource Technology, 2009,100(2):839-844.

[7]Whyte L G, Slagman S J, Pietrantonio F, et al. Physiological adaptations involved in alkane assimilation at a low temperature by Rhodococcus sp. Strain Q15 [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(7):2961-2968.

[8]Wick L, Munain A D, Springael D, et al. Responses of Mycobacterium sp. LB501T to the low bioavailability of solid anthracene [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002,58(3):378-385.

[9]Lang S, Philp J C. Surface-active lipids in rhodococci [J].Antonie Van Leeuwenhoek, 1998,74(1):59-70.

[10]Beal R, Betts W B. Role of rhamnolipid biosurfactants in the uptake and mineralization of hexadecane in Pseudomonas aeruginosa [J]. Journal of Applied Microbiology, 2000,89(1):158-168.

[11]Bateman J N, Speer B, Feduik L, et al. Naphthalene association and uptake in Pseudomonas putida [J]. Journal of Bacteriology,1986,166(1):155-161.

[12]Bugg T, Foght J M, Pickard M A, et al. Uptake and active efflux of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens LP6a [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(12):5387-5392.

[13]Li Y, Wang H, Hua F, et al. Trans-membrane transport of fluoranthene by Rhodococcus sp. BAP-1and optimization of uptake process [J]. Bioresource Technology, 2014,155(155C):213-219.

[14]Kallimanis A, Frillingos S, Drainas C, et al. Taxonomic identification, phenanthrene uptake activity, and membrane lipid alterations of the PAH degrading Arthrobacter sp. strain Sphe3 [J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2007,76(3):709-717.

[15]Miyata N, Iwahori K, Foght J M, et al. Saturable, energydependent uptake of phenanthrene in aqueous phase by Mycobacterium sp. Strain RJGII-135 [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004,70(1):363-369.

[16]Hua F, Wang H Q, Li Y, et al. Trans-membrane transport of n-octadecane by Pseudomonas sp. DG17 [J]. Journal of Microbiology, 2013,51(6):791-799.

[17]Alvarez H M, Mayer F, Fabritius D, et al. Formation of intracytoplasmic lipid inclusions by Rhodococcus opacus strain PD630 [J]. Archives of Microbiology, 1996,165(6):377-386.

[18]Kennedy R S, Finnerty W R. Microbial assimilation of hydrocarbons. I. The fine-structure of a hydrocarbon oxidizing Acinetobacter sp [J]. Archives of Microbiology, 1975,102(2):75-83.

[19]Li Y, Wang H, Hua F. Uptake Modes of Fluoranthene by Strain Rhodococcus Sp. Bap-1 [J]. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2013,27(6):4256-4262.

[20]易 修,袁嘉韓,顧鎖娣,等.小麥根系吸收萘、菲、芘的動力學特征 [J]. 環(huán)境科學學報, 2013,33(4):1135-1140.