全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀在異常血紅蛋白篩查中的應(yīng)用

許偉華，劉冬霞，龍輝，胡新年，湯美芬

(清遠(yuǎn)市婦幼保健院優(yōu)生與遺傳實(shí)驗(yàn)診斷中心，廣東 清遠(yuǎn)511515)

血紅蛋白病是一類(lèi)由于血紅蛋白（hemoglobin，Hb）結(jié)構(gòu)異?；蚝铣闪坎蛔愣鸬倪z傳性血液??；地中海貧血是由于組成血紅蛋白的珠蛋白鏈合成量不平衡而引起貧血；異常血紅蛋白則是因?yàn)檠t蛋白的珠蛋白鏈一級(jí)分子結(jié)構(gòu)異常所引起的血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)改變，如Hb S病、Hb E病等[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的異常血紅蛋白有700多種，其中大多數(shù)是α鏈和β鏈的變異，并且以單個(gè)堿基的替代為主[2]。我國(guó)人群中，多數(shù)類(lèi)型的異常血紅蛋白沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)，但有少數(shù)異常血紅蛋白單獨(dú)（如Hb CS純合子）存在或復(fù)合地中海貧血（如Hb E/β-地中海貧血）時(shí)，表現(xiàn)為中間型或重型地中海貧血。因此，在地貧的高發(fā)地區(qū)，異常血紅蛋白的篩查及診斷十分重要。鑒定Hb的傳統(tǒng)方法主要有醋酸纖維膜電泳、瓊脂凝膠電泳等，但都操作過(guò)于繁瑣，費(fèi)時(shí)且檢出率低。近幾年發(fā)展起來(lái)的全自動(dòng)毛細(xì)管電泳（CE）高度自動(dòng)化，在地中海貧血篩查中有較好的敏感性和特異性，因此被廣泛的應(yīng)用臨床實(shí)驗(yàn)室。

在這項(xiàng)研究中，我們利用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀對(duì)12257例標(biāo)本進(jìn)行了血紅蛋白分析，同時(shí)將篩查出的異常蛋白陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行了基因檢測(cè)鑒定，旨在了解全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳儀在異常血紅蛋白篩查中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年1月至2016年12月在本院門(mén)診及住院患者12257例，其中男性4902例，女性7355例，共檢出異常血紅蛋白標(biāo)本232例，其中男性101例，女性 131例，年齡 14～44歲，平均年齡為29歲，并在知情同意情況下進(jìn)行進(jìn)一步地貧基因檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 毛細(xì)管血紅蛋白電泳 法國(guó)Sebia公司生產(chǎn)的Capillarys2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及其配套血紅蛋白電泳試劑盒CAPILLARYS HEMOGLOBIN(E)。

1.2.2 地貧基因檢測(cè) 診斷試劑盒由深圳亞能公司提供，DNA提取為廈門(mén)至善全自動(dòng)核酸提取儀Lab-Aid820及磁珠法DNA提取試劑，擴(kuò)增儀為伯樂(lè)BIO RAD-100擴(kuò)增系統(tǒng)；雜交儀為韓國(guó)fine PCR公司Combi H12雜交儀，電泳為DYY-8C型電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 毛細(xì)管血紅蛋白電泳 按照儀器操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，標(biāo)本用新鮮EDTA-K2抗凝全血無(wú)需洗滌、溶血和離心，直接裝上樣本架送入Capillarys2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)，約30min讀取結(jié)果。

1.3.2 地貧基因檢測(cè) 新鮮枸櫞酸鈉抗凝全血，DNA提取、擴(kuò)增反應(yīng)、gap-PCR檢測(cè)缺失型α-地貧、RDB-PCR檢測(cè)非缺失型α-地貧及β-地貧基因分析，操作程序嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行，檢測(cè)中國(guó)人常見(jiàn)的 3 種缺失型 α-地貧：--SEA、-α3.7、-α4.2；3 種非缺失型 α-地貧 αCS、αQS、αWS； 以及 17 種β-地貧基因突變 CD41-42 （-TTCT）、IVSII-654（C→T）、-29（A→G）、-28（A→G）、CD71-72（+A）、CD17（A→T）、CD43（G→T）、CD26（GAG→AAG）、CD27/28（+C）、CD31（-C）、-32（C→A）、-30（T→C）、CD14-15（+G）、IVS-I-1（G→A，G→T）、IVS-I-5（G→C）、Int（ATG→AGG）、CAP（A→C）。

2 結(jié)果

2.1 異常血紅蛋白檢測(cè) 在12257例樣本中，共發(fā)現(xiàn)9種類(lèi)型異常血紅蛋白，共計(jì)232例，異常血紅蛋白發(fā)生率1.89%，其中以Hb H、Hb CS、Hb E為主，分別為 64例、60例、52例，占比 27.59%、25.86%、22.41%。9種異常血紅蛋白分布情況見(jiàn)表1，檢出的各種異常血紅蛋白電泳圖譜見(jiàn)圖1。

2.2 Hb H病的基因分析 篩查出的64例Hb H病例中，單純Hb H 18例，Hb H合并Hb Bart’s有37例，Hb H合并Hb CS 7例，Hb H合并Hb CS及Hb Bart’s有2例。對(duì)其進(jìn)行地貧基因檢測(cè)，基因型分別為--SEA/-α3.7 35例、--SEA/-α4.2 18例、--SEA/α（QS）α 2例和--SEA/α（CS）α 9例。 64例Hb H病的地貧基因確診分型情況見(jiàn)表2。

2.3 Hb CS的基因分析 檢測(cè)出的60例Hb CS病例中，單純CS帶51例，H帶合并CS帶7例，H帶合并CS帶及Bart’s帶有2例。對(duì)其進(jìn)行地貧基因檢測(cè)，結(jié)果為--SEA/α（CS） α 9 例、α（CS） α/αα 48例、α（CS） α/α（WS） α 1例以及 αα/αα 2例。60例Hb CS的地貧基因確診分型情況見(jiàn)表3。

表1 232例異常血紅蛋白患者異常血紅蛋白分類(lèi)及分布情況

圖1 各種異常血紅蛋白毛細(xì)管電泳圖譜

表2 64例Hb H病的地貧基因確診分型情況

表3 60例Hb CS的地貧基因確診分型情況

2.4 其他異常血紅蛋白分類(lèi)及地貧基因確診情況檢出Hb E標(biāo)本共52例，基因檢測(cè)結(jié)果為βCD26/βN 51例，βCD26/β-28 1例，血紅蛋白 E 病檢出率100%。檢出Hb Q標(biāo)本8例，Q帶常見(jiàn)于Z7區(qū)，同時(shí)在Z1區(qū)可見(jiàn)Hb A2變異體，地貧基因檢測(cè)結(jié)果為-α4.2/αα，βN/βN， 提示異常血紅蛋白 Q 合并-α4.2缺失。另外，檢出Hb F異常增高（＞10%）及Hb K（K 帶常見(jiàn)于 Z11 區(qū)）、Hb J（J帶常見(jiàn)于 Z12區(qū)）、Hb G（G帶常見(jiàn)于Z6區(qū)）常規(guī)地貧基因檢測(cè)結(jié)果顯示正常，需進(jìn)一步進(jìn)行罕見(jiàn)地貧檢測(cè)，必要時(shí)進(jìn)行基因測(cè)序才能檢測(cè)出結(jié)果。其他異常血紅蛋白分布情況及地貧基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 其他異常血紅蛋白分布及地貧基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)應(yīng)用于地貧篩查的工具，以其全自動(dòng)、快速、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用[3]，其原理主要是利用充滿(mǎn)電泳液的石英毛細(xì)管中，以溶血?jiǎng)┻M(jìn)行稀釋的紅細(xì)胞樣品在高壓電的作用下進(jìn)行分離。當(dāng)樣品進(jìn)入到毛細(xì)管中，無(wú)論是帶正電、負(fù)電或不帶電的粒子，都在電滲流的作用下，向陰極遷移。帶電粒子的性質(zhì)、數(shù)量及體積能夠影響其在毛細(xì)管中的遷移速率，從而在電泳區(qū)域形成電泳圖譜，Sebia Capillarys 2分析軟件根據(jù)電泳速率劃分為15個(gè)區(qū)域[4]，每個(gè)區(qū)域有數(shù)據(jù)庫(kù)提示可能為何種血紅蛋白變異體。因而，能快速的對(duì)所檢測(cè)到的異常血紅蛋白進(jìn)行判斷分析。

目前已發(fā)現(xiàn)的異常血紅蛋白有700多種，在我國(guó)發(fā)現(xiàn)70多種，其中大多數(shù)為珠蛋白α鏈和β鏈的變異[5]。在我國(guó)異常血紅蛋白發(fā)生率為0.337%，具有高度的分布不均一性和遺傳多態(tài)性，主要以南方地區(qū)為主，其中云南省最高，為5.93%，廣東省為0.393%。在南方地區(qū)常見(jiàn)的異常血紅蛋白主要為Hb E和Hb J，而北方則主要為Hb E和Hb D[6]。本研究利用毛細(xì)管血紅蛋白分析系統(tǒng)共篩查了12257例樣本，檢出9種異常血紅蛋白共232例，異常血紅蛋白發(fā)生率1.89%。其中Hb H 64例、Hb CS 60例、Hb E 51例；發(fā)生率分別為：0.52%、0.49%、0.42%；診斷準(zhǔn)確度分別為100%、96.67%、100%，診斷準(zhǔn)確度與文獻(xiàn)報(bào)道相近[7，8]。

Hb H病中α珠蛋白鏈的減少或缺乏使γ珠蛋白鏈和β珠蛋白鏈相對(duì)增多，多余的γ鏈聚合成 Hb Bart’s（γ4），β 鏈則聚合成 Hb H（β4），毛細(xì)管血紅蛋白電泳可檢測(cè)出不同水平的Hb H、Hb Bart’s和 Hb CS，其中 Hb H 含量約為 0.18%～40%[9]。而傳統(tǒng)的醋酸纖維薄膜電泳無(wú)法準(zhǔn)確定量，且受主觀(guān)因素影響大。本次篩查出的64例Hb H病樣本基因檢測(cè)表明，Hb H病主要以缺失型為主，且以--SEA/-α3.7（又稱(chēng)右缺失 RW）為主，占54.69%。非缺失型Hb H病比例較小，主要為--SEA/α（CS） α，占 14.05%。

Hb CS是α2-珠蛋白基因終止密碼子CD142（UAA＞CAA）突變，降低mRNA穩(wěn)定性而引起表達(dá)水平降低，是一種不穩(wěn)定性Hb，常位于Z2區(qū)帶，但不同時(shí)間解離后區(qū)帶位置不同，純合Hb CS，在電泳中定量為5%～8%，而雜合Hb CS含量很低，僅占0.5%～1%，在一般的醋酸纖維薄膜電泳中很難檢出，但在全自動(dòng)電泳系統(tǒng)中可以檢出[10，11]。本研究中共檢測(cè)出60例Hb CS，地貧基因檢測(cè)結(jié)果有58例為αCS α攜帶者，有2例未發(fā)現(xiàn)異常，其原因可能與不穩(wěn)定血紅蛋白降解有關(guān)。

Hb E病是東南亞最常見(jiàn)的異常血紅蛋白病之一，是由于β珠蛋白肽鏈第26位的密碼子GAG突變?yōu)锳AG，導(dǎo)致Glu變成Lys，影響到mRNA前體加工的效率，從而導(dǎo)致β珠蛋白肽鏈合成減少，是一種β地中海貧血樣的血紅蛋白病。在毛細(xì)管電泳中，Hb E帶常見(jiàn)于電泳圖譜Z4區(qū)，不僅與Hb A2條帶分離，還能對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量。本結(jié)果中的52例Hb E進(jìn)行地貧基因檢測(cè)全部為βCD26攜帶者，診斷準(zhǔn)確度100%，其中1例Hb E合并β-28，表現(xiàn)為中間型地貧。

Hb Q是一種慢速異常血紅蛋白，常見(jiàn)于Z7區(qū)，同時(shí)在Z1區(qū)可見(jiàn)Hb A2變異體，本結(jié)果檢出Hb Q標(biāo)本8例，均檢測(cè)出-α4.2，與報(bào)道Hb Q均伴隨一個(gè)4.2缺失型α地貧的發(fā)生一致[12-15]。另外，也檢測(cè)出 Hb F異常增高（＞10%）、Hb K（K帶常見(jiàn)于Z11區(qū)）、Hb J（J帶常見(jiàn)于Z12區(qū)）及Hb G（G帶常見(jiàn)于Z6區(qū)），常規(guī)地貧基因檢測(cè)結(jié)果均未見(jiàn)異常，需進(jìn)一步進(jìn)行罕見(jiàn)地貧檢測(cè)，必要時(shí)進(jìn)行基因測(cè)序才能予以確診。

綜上所述，毛細(xì)管血紅蛋白分析儀能快速、準(zhǔn)確地篩查出各種常見(jiàn)異常血紅蛋白，特別在地貧高發(fā)區(qū)，應(yīng)用于婚前、孕前、產(chǎn)前異常血紅蛋白的篩查，能避免異常血紅蛋白復(fù)合地中海貧血（如Hb E/β-地中海貧血）的中間型或重型出生缺陷的發(fā)生。對(duì)遺傳指導(dǎo)及產(chǎn)前診斷具有重要意義。本研究首次報(bào)道了清遠(yuǎn)地區(qū)異常血紅蛋白的發(fā)生率，對(duì)今后的地貧防控具有一定指導(dǎo)及參考作用。

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