VEGFR-1、VEGFR-2和HGF表達(dá)情況與乙肝發(fā)病相關(guān)性及作用機(jī)制分析

劉圓方，樊宏偉，高改云，倪猛，李靜

(南陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科一病區(qū)，河南 南陽473000)

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）可通過多種途徑侵入人體，進(jìn)而誘發(fā)多種感染，而其感染結(jié)果常取決于患者的年齡。另外，相關(guān)研究[1]發(fā)現(xiàn)宿主免疫因素也在HBV的感染過程中具有重要地位。肝臟出現(xiàn)病變時(shí)，肝細(xì)胞死亡后新的肝細(xì)胞再生，其刺激再生體液主要來自肝外組織、肝臟以及肝內(nèi)有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF）和胰島素生長(zhǎng)因子。劉哲[2]的研究已證實(shí)HGF可加強(qiáng)對(duì)肝損傷的保護(hù)并可作為肝損傷的重要判斷指標(biāo)。

相關(guān)資料[3]顯示血管的成熟和新生在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中作用顯著，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（Vascular endothelial growth factor，VEGFR）-1、VEGFR-2、VEGF及HGF均于血管新生具有密切聯(lián)系。肝臟具有較強(qiáng)血液運(yùn)輸能力，其相關(guān)因子的調(diào)控作用對(duì)于維持肝臟的正常功能具有重要作用。上述因子關(guān)于肝癌的研究較多，但關(guān)于乙肝的相關(guān)研究相對(duì)較少。因此，本研究探究了VEGFR-1、VEGFR-2和HGF表達(dá)情況與乙肝發(fā)病相關(guān)性分析及作用機(jī)制，取得了較好的結(jié)果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院在2016年1月至2017年7月期間收治的、符合納入標(biāo)準(zhǔn)的CHB患者80例。CHB患者年齡22~74歲，平均年齡 （37.25±10.17）歲；男性57例，女性23例；根據(jù)分組標(biāo)準(zhǔn)分為：⑴抗病毒組（n=14）：HBeAg 陽性（或陰性）患者經(jīng)我院治療后ALT恢復(fù)正常，HBeAg血清轉(zhuǎn)換，PCR檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)HBV DNA；⑵HBeAg陽性組（n=24）：血清 ALT 升高＞60U/L，抗-HBe 陰性，肝組織學(xué)檢查肝炎病變；⑶HBeAg 陰性組（n=24）：HBeAg陰性，抗-HBe陰性或陽性，HBsAg和HBV DNA陽性，血清 ALT 異常＞60U/L；⑷肝衰竭組（n=18）：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)及中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制定的肝衰竭診療指南[4]。所有病例均排除酒精性肝炎、脂肪性肝炎、肝炎病毒感染、藥物性肝炎及其他疾病。同期選擇我院門診體檢并注射乙肝疫苗者22例（對(duì)照組），其中男性15例，女性 7例；年齡 24~47歲，平均年齡（28.13±10.52）歲；對(duì)照組患者肝功能均正常，無肝炎病毒感染，無急、慢性疾病。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者及其家屬均知情同意，并簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清HBVM檢測(cè) 定量檢測(cè)使用免疫熒光分析法檢測(cè)血清HBVM濃度；定性檢測(cè)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清HBVM濃度。試劑盒購于深圳匹基生物工程公司。

1.2.2 HBV DNA檢測(cè) 熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA水平，試劑盒購于南京建成生物研究所。

1.2.3肝功能檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀 （型號(hào)OLYMPUSAU，美國(guó)GE公司生產(chǎn)）檢測(cè)患者肝功能。

1.2.4 HGF檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)HGF水平，試劑盒購于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2.5 VEGFR-1及VEGFR-2檢測(cè) 使用我院液相懸浮芯片系統(tǒng)（型號(hào)Luminex200，德國(guó)西門子公司生產(chǎn)），對(duì)血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)細(xì)胞因子試劑盒均購于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用t/F檢驗(yàn)判斷其差異程度；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比形式表示，運(yùn)用χ2/Fisher確切概率法檢驗(yàn)判斷其差異程度，采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)其相關(guān)性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平 五組VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.50、6.75、27.84，P<0.01）；組間比較發(fā)現(xiàn)抗病毒組VEGFR-1水平均低于HBeAg陽性組、HBeAg陰性組及肝衰竭組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組VEGFR-2及HGF均低于抗病毒組、HBeAg陽性組、HBeAg陰性組及肝衰竭組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；抗病毒組HGF水平均低于HBeAg陽性組、HBeAg陰性組及肝衰竭組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HBeAg陽性組HGF水平均低于HBeAg陰性組及肝衰竭組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）；HBeAg陰性組HGF水平均低于肝衰竭組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05），見表 1。

2.2 病毒載量與VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平 高病毒載量組的VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平均高于低病毒載量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.14、10.98、2.72，P<0.01），見表 2。

2.3 VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平與肝功能指標(biāo)、HBV DNA的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，VEGFR-1、VEGFR-2及HGF與ALT、AST 及 Tbil均呈正相關(guān)關(guān)系 （r=0.29、0.52、0.37、0.48、0.59、0.70、0.53、0.55、0.33，P＜0.05）；VEGFR-1、VEGFR-2及HGF與HBV DNA無相關(guān)性（r=0.13、0.19、0.15，P＞0.05）；VEGFR-1 與 VEGFR-2 及 HGF呈正相關(guān)關(guān)系 （r=0.53、0.68，P＜0.05）；VEGFR-2 與HGF 呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.47，P＜0.01）。

表1 各組VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平(x±s，pg/ml)

表2 病毒載量與VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平(x±s，pg/ml)

3 討論

乙型病毒性肝炎是由HBV引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鞯囊环N疾病。此外，其還可能引起以腎臟為主的其它器官損害。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染乙肝病毒，其中2.4億人為慢性乙肝病毒感染者，每年約有65萬人死于乙肝病毒感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)[5]。全球肝硬化和HCC患者中，由乙肝病毒感染引起的比例分別為30%和45%[6]。由此可見，乙肝已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性疾病，也是我國(guó)當(dāng)前流行最為廣泛、危害性最嚴(yán)重的一種疾病。

乙肝發(fā)展的主要基礎(chǔ)是血管新生。VEGF是調(diào)節(jié)血管新生最特異的細(xì)胞因子，亦是作用最強(qiáng)的因子，其可與VEGFR有效結(jié)合并發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。HCG是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分裂的多功能細(xì)胞因子，有刺激體內(nèi)血管的再生，對(duì)某些腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)同樣具有重要影響作用[6，7]。VEGF及HGF因均參與腫瘤血管的心聲，故與肝癌血管增生過度具有密切關(guān)系，此外在血管成熟過程中同樣具有類似相同作用，進(jìn)而存在出現(xiàn)一定的協(xié)同作用，進(jìn)一步調(diào)控血管生成和血管內(nèi)皮的通透[8]。但上述因子在肝癌的研究較多，關(guān)于乙肝的相關(guān)研究相對(duì)較少。故此，本研究探究了VEGFR-1、VEGFR-2和HGF表達(dá)情況與乙肝發(fā)病相關(guān)性分析及作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)五組 VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；高病毒載量組的VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平均高于低病毒載量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。上述結(jié)果提示隨著乙肝的病毒的浸潤(rùn)及程度的加深，VEGFR-1、VEGFR-2及HGF水平也逐漸升高。我們認(rèn)為VEGFR-1、VEGFR-2及HGF具有成為評(píng)價(jià)乙肝發(fā)展程度的生物學(xué)治療的重大潛力。隨著乙肝程度的加深，VEGF表達(dá)升高，進(jìn)而誘導(dǎo)相應(yīng)血管新生，形成一個(gè)循環(huán)[9]。VEGFR-1、VEGFR-2均為VEGF受體，VEGFR-1主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)，VEGFR-2主要在肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，鐘武[10]的研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織的VEGFR-1、VEGFR-2表達(dá)率顯著高于癌旁組織，這提示VEGFR-1、VEGFR-2在腫瘤組織的發(fā)展過程中具有重要作用。HGF最先在重型肝炎患者中純化，并逐漸在肝硬化幾慢性肝炎患者的腹水中發(fā)現(xiàn)，各種肝臟疾病均可誘發(fā)HCG的表達(dá)，Kanazawa H[11]認(rèn)為肝病患者HCG水平的變化可有效反映肝細(xì)胞修復(fù)和壞死的程度。肝硬化和慢性重癥肝炎患者因肝臟代謝能力下降HCG的被清除率也隨之下降，此外一些相關(guān)炎性因子的濃度升高刺激非實(shí)質(zhì)細(xì)胞加速合成HGF，進(jìn)而導(dǎo)致 HCG 含量升高[12，13]。

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，VEGFR-1、VEGFR-2及 HGF 與 ALT、AST 及 Tbil均呈正相關(guān)關(guān)系 （P＜0.05）；VEGFR-1 與 VEGFR-2 及HGF 呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；VEGFR-2 與 HGF 呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。 上述結(jié)果提示，VEGFR-1、VEGFR-2及HGF可作為判斷乙肝疾病發(fā)展和預(yù)后的參考指標(biāo)。肝臟出現(xiàn)炎癥時(shí)，在多種炎癥因子的刺激下可刺激肝星狀細(xì)胞，并刺激VEGFR-1、VEGFR-2及HGF的合成[14]。此外，肝細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素生長(zhǎng)因子也可刺激HCG的生成。因肝損傷好轉(zhuǎn)后，激活的星狀細(xì)胞可出現(xiàn)自發(fā)逆轉(zhuǎn)，HCG水平隨之下降，因而，臨床常把HCG作為肝損傷的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[15]。

綜上所述，VEGFR-1、VEGFR-2和 HGF與乙肝發(fā)病密切相關(guān)。

[1]王玲，趙衛(wèi)東.HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá) [J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，13(2)：227-231.

[2]劉哲，張曉梅，秦慧慧，等.肺纖方對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠VEGF及VEGFR1、VEGFR2基因表達(dá)的影響 [J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37(11)：753-757.

[3]朱丹，新吉夫，郭凱，等.VEGFR-1和VEGFR-2在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)的變化[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2015，33(1)：42-46.

[4]徐江霞，龔淑琪，萬振華，等.新型乙肝定量PCR試劑檢測(cè)性能驗(yàn)證[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，34(2)：149-151.

[5]湯海玲，范麗梅，韓珍，等.乙肝相關(guān)肝癌各臨床分期中血管新生相關(guān)因子的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，21(6)：882-883.

[6]Nakagawa T，Matsushima T，Kawano S，et al.Lenvatinib in combination with golvatinib overcomes hepatocyte growth factor pathway-induced resistance to vascular endothelial growth factor receptor inhibitor[J].Cancer Science，2014，105(6)：723-730.

[7]田雪飛，黃曉蒂，周青，等.歸肝經(jīng)中藥作用于人肝癌細(xì)胞差異表達(dá) 蛋白酪氨酸激酶的篩選與分析 [J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2015，22(3)：227-233.

[8]Awada HK，Johnson NR，Wang Y.Dual delivery of vascular endothelial growth factor and hepatocyte growth factor coacervate displays strong angiogenic effects[J].Macromolecular Bioscience，2014，14(5)：679.

[9]孫立，閆冬，原泉，等.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子可溶性受體1與慢性腎小球腎炎相關(guān)性研究 [J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2016，13(6)：469-471.

[10]鐘武，楊帆，陳睦虎，等.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2在慢性靜脈性潰瘍組織中表達(dá)的研究 [J].重慶醫(yī)學(xué)，2015，44(20)：2756-2758.

[11]Kanazawa H，Tochino Y，Asai K，et al.Simultaneous Assessment of Hepatocyte Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor in Epithelial Lining Fluid From Patients With COPD[J].Chest，2014，146(5)：1159-1165.

[12]陶鵬輝.乙型肝炎病毒感染者血清HBV DNA與IL-21及IFN-γ水平的相關(guān)性[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，35(3)：347-350.

[13]El-Gohary AM，Attia FM，Eldin ARG，et al.Vascular endothelial growth factor mRNA expression can be a marker for response to antiviral treatment of HCV [J].Comparative Clinical Pathology，2014，23(4)：923-928.

[14]姚楊，蘇杰，徐銳，等.水通道蛋白1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)及其意義 [J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，21(19)：3189-3192.

[15]莫之婧，李康智，馬義麗，等.基于基因表達(dá)譜分析的乙肝陽性轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制分析 [J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，31(4)：1272-1279.