大豆凝集素的分離純化及血凝效果研究

湛潤(rùn)生，紀(jì)麗穎，邢寶龍，張旭麗

(1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009;2.山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西大同037009；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所，山西大同037008）

凝集素（agglutinin）是一類含糖（少數(shù)例外）并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細(xì)胞和刺激細(xì)胞分裂的作用，廣泛存在于各種真菌、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、人體以及某些病毒體內(nèi)。常用的植物凝集素(PNA)，通常以其被提取的植物命名，如麥胚凝集素(WGA)、花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)等[1-4]。在細(xì)胞表面，組成細(xì)胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖鏈，形成細(xì)胞外被（又被稱為糖萼）。凝集素能與細(xì)胞外被中的糖分子連接，在細(xì)胞間形成“橋”，從而引起細(xì)胞凝集[5－6]。

大豆凝集素（soybean agglutinin，SBA）是最早被描述的植物凝集素之一，利用凝集素與不同的糖蛋白特異性結(jié)合的原理，大豆凝集素在糖生物化學(xué)、血型鑒定、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[7-11]。同時(shí)作為大豆中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，大豆凝集素可對(duì)動(dòng)物腸壁、刷狀緣酶活性、小腸黏膜細(xì)胞代謝、腸道細(xì)菌生態(tài)物質(zhì)代謝及免疫機(jī)能產(chǎn)生一定的影響[12]。因此開(kāi)展大豆凝集素提取工藝及凝集活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)尤為重要，本實(shí)驗(yàn)采用生理鹽水提取的方法分離純化得到大豆凝集素樣品，并對(duì)其血凝活性進(jìn)行了研究，旨在探索不同大豆凝集素含量的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所提供，分別是晉科5號(hào)、晉豆25號(hào)、長(zhǎng)豆34號(hào)、晉遺57號(hào)和晉遺59號(hào)。

1.2 主要試劑

0.9 %NaCl溶液；肝素鈉注射液（河南省國(guó)藥醫(yī)藥有限公司）。

1.3 主要儀器

冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（上海精科天美科學(xué)有限公司)；生物顯微鏡CKX41（日本OLYMPUS公司）；分光光度計(jì)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

主要依據(jù)參考文獻(xiàn)[13－15]進(jìn)行。

1.4.1 大豆中凝集素的提取及其純化

稱取不同品種大豆10g，用0.9%NaCl溶液清洗干凈，加入100 mL 0.9%NaCl溶液在4℃的冰箱中浸泡24h，用研缽將大豆研碎。在大豆粉中加入100 mL 0.9%NaCl溶液，置于4℃冰箱中放置一夜抽提。將大豆混合物用4層紗布過(guò)濾，將過(guò)濾好的濾液放到5 000 r∕min冷凍離心機(jī)中離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移到燒杯中，4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 紅細(xì)胞懸液的制備

以無(wú)菌方法抽取兔耳緣靜脈血液（5 mL注射器先吸取3 mL 1%肝素溶液）1 mL，用0.9%NaCl溶液洗滌5次，每次3 000 r∕min離心5 min，最后按沉淀紅細(xì)胞體積用0.9%NaCl溶液配成2%紅細(xì)胞懸液。

1.4.3 血凝反應(yīng)的測(cè)定

吸取大豆凝集素提取液和紅細(xì)胞懸液各1滴在載玻片上，充分混勻，靜置15 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察凝集效果。并用0.9%NaCl溶液作為空白對(duì)照，觀察凝血效果。

1.4.4 凝集素相對(duì)含量的測(cè)定

1）將相同體積試管洗凈滅菌后烘干稱重，然后向各管內(nèi)分別加入不同品種大豆凝集素提取液5 mL，并且用0.9%NaCl溶液做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2）在各試管內(nèi)同時(shí)加入1 mL的2%的紅細(xì)胞懸液，充分搖晃均勻，15 min內(nèi)觀察紅細(xì)胞的凝集情況。

3）在其中一種豆子中的紅細(xì)胞團(tuán)最先完全積淀的同一時(shí)刻，取出每個(gè)試管中的一部分上液，使每一個(gè)試管內(nèi)的溶液都維持在同一刻度。與此同時(shí)再向各個(gè)試管內(nèi)取2 mL的溶液于比色皿中，于分光光度計(jì)內(nèi)測(cè)定其在620 nm時(shí)的吸光度值（OD）。

4）將每個(gè)試管中的溶液全部用膠頭滴管取出，此時(shí)試管中只有紅細(xì)胞凝塊，然后再將試管放入烘干箱內(nèi)烘干后稱重。

1.4.5 凝集程度的判別與記錄

試管內(nèi)的溶液是清澈的，液體內(nèi)的血紅細(xì)胞在試管底部完全凝集后，輕輕搖晃試管時(shí)，可在試管內(nèi)見(jiàn)到大的凝塊，為高度凝集（++）；試管內(nèi)的液體渾濁，試管底部可觀察到較小的凝塊，為輕度凝集（+）；試管內(nèi)的液體中的紅細(xì)胞分布均勻，試管底部未觀察到凝塊，為不凝集（－）。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞凝集反應(yīng)

吸取凝集素提取液和紅細(xì)胞懸液各1滴在載玻片上，混均，靜置15 min，觀察結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 凝集素提取液與2%的紅細(xì)胞懸液的凝集反應(yīng)情況

可以看出，除0.9%NaCl、晉遺59號(hào)外，其他4種大豆凝集素提取液都使得紅細(xì)胞懸液有不同程度的凝集。晉科5號(hào)、長(zhǎng)豆34號(hào)使得紅細(xì)胞凝集程度最高，證明其凝集素含量最高；晉豆25號(hào)、晉遺57號(hào)使得紅細(xì)胞凝集程度次之，證明其凝集素含量相對(duì)較低。

2.2 發(fā)生凝集反應(yīng)后上清液的吸光值

發(fā)生凝集反應(yīng)后，在各試管內(nèi)取2 mL溶液放入比色皿中，于分光光度計(jì)內(nèi)測(cè)定其在620 nm時(shí)的吸光值（OD）。見(jiàn)表2。

表2 凝集素與2%紅細(xì)胞懸液作用后上清液吸光值

當(dāng)大豆中凝集素含量高時(shí)，凝集素使得溶液中的紅細(xì)胞大量凝集，發(fā)生凝集反應(yīng)后溶液澄清，吸光度值較??；反之，當(dāng)凝集素含量低時(shí)，溶液中的紅細(xì)胞較少凝集，溶液渾濁，吸光度值較大。總體來(lái)說(shuō)，不同品種大豆凝集素含量順序?yàn)椋簳x科5號(hào)＞長(zhǎng)豆34號(hào)＞晉豆25號(hào)、晉遺57號(hào)＞晉遺59號(hào)。

2.3 凝集紅細(xì)胞沉淀的干重

發(fā)生凝集反應(yīng)后，用膠頭滴管將試管內(nèi)的溶液全部吸走，試管內(nèi)余下紅細(xì)胞凝塊，將試管及血凝塊一起放入烘干箱內(nèi)烘干稱重。

大豆中凝集素含量較高時(shí)，實(shí)驗(yàn)中血凝反應(yīng)效果明顯，紅細(xì)胞的凝集團(tuán)較大，最后所得凝集紅細(xì)胞沉淀的干重較大。反之，凝集素含量低時(shí)，血凝反應(yīng)的效果不明顯，紅細(xì)胞的凝集團(tuán)較小，最后所得沉淀的干重較小。凝集素含量順序?yàn)?，晉科5號(hào)＞長(zhǎng)豆34號(hào)＞晉豆25號(hào)＞晉遺57號(hào)＞晉遺59號(hào)。見(jiàn)表3。

表3 凝集紅細(xì)胞沉淀的干重/mg

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用山西省廣泛種植的幾種大豆為實(shí)驗(yàn)材料，以0.9%NaCl溶液為提取劑。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的前期提取過(guò)程，通過(guò)觀察紅細(xì)胞凝集狀況，來(lái)初步區(qū)分凝集素含量的高低；再通過(guò)測(cè)定吸光度值和凝集紅細(xì)胞干重，來(lái)進(jìn)一步區(qū)分不同品種大豆凝集素相對(duì)含量的高低。實(shí)驗(yàn)過(guò)程表明，0.9%NaCl溶液作為提取劑對(duì)凝集素的活性影響較小，所得結(jié)果準(zhǔn)確；兔血對(duì)血液的凝集反應(yīng)也有較高的靈敏性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同品種大豆凝集素含量區(qū)分明顯，晉科5號(hào)含量最高，長(zhǎng)豆34號(hào)含量含量次之，晉豆25號(hào)和晉遺57號(hào)含量相對(duì)較低，晉遺59號(hào)含量最低。相信隨著科技不斷發(fā)展，新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，今后對(duì)于大豆凝集素的提取方法會(huì)越來(lái)越精確，同時(shí)也會(huì)發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的關(guān)于大豆凝集素在生物學(xué)方面的應(yīng)用。

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