PD-L1對過敏性鼻炎小鼠Treg/Th17細胞免疫失衡調(diào)節(jié)作用研究*

王 頔，唐橋斐，姜玉秋，張 爽，李賽楠，閆智永

沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科(沈陽110200)

PD-L1對過敏性鼻炎小鼠Treg/Th17細胞免疫失衡調(diào)節(jié)作用研究*

王 頔，唐橋斐，姜玉秋，張 爽，李賽楠，閆智永△

沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科(沈陽110200)

*沈陽醫(yī)學(xué)院科研基金資助項目(20161006)

△通訊作者

目的：探討PD-L1對過敏性鼻炎小鼠Treg/Th17細胞免疫失衡的調(diào)節(jié)作用。方法：將30只BALB/c小鼠隨機分三組，模型組和PD-L1重組蛋白干預(yù)組給予卵清蛋白(OVA)誘發(fā)過敏性鼻炎，PD-L1重組蛋白干預(yù)組給予PD-L1重組蛋白進行處理；正常對照組在相同時間點給予生理鹽水。采用疊加量化記分法進行搔鼻、噴嚏及鼻溢癥狀評價；采用HE染色觀察鼻黏膜組織的病理變化，采用免疫組化檢測鼻黏膜組織PD-1和PD-L1的表達；Western blot檢測鼻粘膜組織p-AKT、、AKT、mTOR、p-mTOR的表達；RT-PCR檢測鼻黏膜組織調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)重要轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、RORγt表達；ELISA法檢測血清IL-10、IL-17A、IL-6的水平。結(jié)果：正常對照組、模型組、PD-L1重組蛋白干預(yù)組行為學(xué)評分分別為0、(6.33±1.15)、(3.67±0.58)分，組間比較具有統(tǒng)一學(xué)意義(P<0.05)。與正常對照組相比較，模型組鼻粘膜組織損傷嚴重，鼻粘膜組織中PD-1、PD-L1和Foxp3的表達下降，RORγt、p-AKT、p-mTOR的表達增加，血清IL-10水平下降，血清中IL-17A、IL-6的水平升高，AKT、mTOR的表達無明顯變化。與模型組相比較，PD-L1重組蛋白干預(yù)組鼻粘膜組織損傷減輕，鼻粘膜組織中PD-1和PD-L1和Foxp3的表達上升，RORγt、p-AKT、p-mTOR表達下降，血清IL-10水平升高，血清中IL-17A、IL-6的水平下降；組間比較差異顯著(P<0.05)；AKT、mTOR無明顯變化。結(jié)論：PD-L1通過抑制AKT-mTOR信號進而促進Treg的分化抑制過敏性鼻炎的發(fā)生和發(fā)展。

過敏性鼻炎是機體接觸變應(yīng)原后主要由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性疾病[1]。過敏性鼻炎是全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的過敏性疾病，近20年來我國成人及兒童過敏性鼻炎發(fā)病率均呈逐年增加趨勢[2]，已經(jīng)嚴重影響到人類的生活質(zhì)量、工作效率、精神狀態(tài)及睡眠等。既往研究認為過敏性鼻炎的發(fā)病由Th1細胞、Th2細胞免疫失衡引起，且主要與Th2細胞應(yīng)答增強有關(guān)[3]。但近年來研究顯示，過敏性鼻炎發(fā)病過程中出現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、輔助性T細胞17(Th17)比例下調(diào)[4]。Treg被認為是一群具有免疫抑制作用的細胞，主要分泌TGF-β1和IL-10，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3(Forkhead box p3，F(xiàn)oxp3)是其重要調(diào)控基因[5]；Th17細胞是另一種新的T細胞亞群[5]，以分泌IL-17A細胞因子為特征，在促進炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用[6]。程序性死亡分子PD-1及其配體PD-L1是CD28/B7超家族的協(xié)同刺激分子，介導(dǎo)免疫反應(yīng)的負性調(diào)節(jié)信號。PD-1/PD-L1信號途徑在Treg細胞增殖、分化以及功能維持中發(fā)揮重要作用。同時，有研究證實PD-L1能夠通過減弱AKT-mTOR信號誘導(dǎo)初始化T細胞向Treg[7]。

本研究通過建立小鼠過敏性鼻炎的模型，使用PD-L1重組蛋白對其進行干預(yù)，檢測干預(yù)后Treg/Th17平衡的變化，從而揭示PD-L1對過敏性鼻炎小鼠Treg/Th17細胞免疫失衡的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1 材料及試劑 6～8周SPF級雄性小鼠BALB/c小鼠30只，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，卵清蛋白(OVA) (美國Sigma公司)、Al(OH)3(天津大茂化學(xué)試劑廠)，PD-L1重組蛋白(英國Abcam公司)，PD-1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，PD-L1多克隆抗體、醇溶的曙紅Y(上海生工生物工程有限公司)，p-AKT、AKT、mTOR(沈陽萬類生物科技有限公司)，p-mTOR(美國CST公司)，蘇木精、DAB顯色液(北京索萊寶科技有限公司)，生物素化山羊抗兔IgG(上海碧云天生物技術(shù)公司)，小鼠IL-6、IL-10、IL-17A ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)，Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒、2×Power Taq PCR Master Mix(北京百泰克生物科技有限公司)，其余的試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 動物模型及分組 將BALB/c小鼠隨機分為三組，每組10只。模型組(AR)、PD-L1重組蛋白干預(yù)組(AR+PD-L1)使用卵清蛋白致敏，100 μg OVA+2 mg氫氧化鋁溶于0.1 ml生理鹽水中，分別于第0、2、4、6、8、10、12、14 d對小鼠進行腹腔注射，之后分別在第15～25 d，予以100 μg OVA(20 μl)滴鼻激發(fā)，1次/d。PD-L1重組蛋白干預(yù)組在刺激前鼻內(nèi)滴注PD-L1重組蛋白(10 μg/20 μl)，對照組及模型組各階段注射生理鹽水作為對照。末次滴鼻局部刺激后2 h處死小鼠，各組小鼠摘除眼球取血后，取各組鼻粘膜組織。

3 行為學(xué)評分 最后一次激發(fā)完成后，觀察小鼠鼻部癥狀，如搔鼻、噴嚏、鼻溢液等，按照如下標準記錄評分：鼻癢：輕度1分，輕搔鼻幾次；重度2分，反復(fù)搔鼻不止，到處摩擦；噴嚏1～3個為1分，4～10個為2分，11個以上為3分；清水涕：流到前鼻孔1分；超過前鼻孔2分；流涕滿面3分，以累計疊加法記錄總分，大于5分表示造模成功。

4 HE染色檢觀察鼻黏膜組織病理變化 取各組小鼠鼻黏膜組織，常規(guī)石蠟包埋并切片，60 ℃溫箱中2 h，烘干切片；二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素浸染5 min，伊紅浸染3 min；常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察組織病理變化。

5 免疫組化檢測鼻黏膜組織PD-1、PD-L1表達 取各組小鼠鼻黏膜組織，常規(guī)石蠟包埋并切片，60 ℃溫箱中2 h，烘干切片；二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，微波加熱修復(fù)抗原；3% H2O2室溫孵育15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉；加入PD-1和PD-L1一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過夜孵育；山羊二抗孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶(HRP)進行標記，DAB顯色；蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察染色情況。PD-1、PD-L1均以細胞質(zhì)呈棕黃色至棕褐色為陽性。

6 Western blot檢測鼻粘膜組織p-AKT、p-mTOR、AKT、mTOR的表達 取各組小鼠鼻黏膜組織，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂乳封閉；加入p-AKT、p-mTOR、AKT、mTOR一抗，4 ℃過夜孵育；加入二抗，37 ℃孵育45 min，ECL顯影，β-actin作為內(nèi)參進行標準化處理。

7 RT-PCR檢測鼻粘膜組織Foxp3和RORγt的表達 收集小鼠鼻粘膜組織，總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA，紫外分光光度測定RNA質(zhì)量濃度及鑒定純度。在Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Primer 5.0設(shè)計上下游引物，引物信息見表1。利用PCR對β-actin、Foxp3和RORγt進行擴增，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃保持5 min使模板DNA充分變性；然后進入擴增循環(huán)，在每一個循環(huán)中，95 ℃保持20 s使模板變性，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)循環(huán)36次；25 ℃保持5 min，使產(chǎn)物延伸完整。對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)對得到的凝膠進行拍照。利用Image J軟件對核酸電泳照片進行灰度分析，得到各樣本中基因的相對表達量。

表1 RT-PCR引物信息

8 ELISA檢測血清IL-10、IL-17A、IL-6水平 取各組血清樣本，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-10、IL-17A、IL-6的水平。

9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 行為學(xué)評分比較 正常對照組無噴嚏、搔鼻及清水涕癥狀；模型組頻繁搔鼻，噴嚏及清水涕較多；PD-L1重組蛋白組較模型組癥狀減輕。對照組、模型組、PD-L1重組蛋白干預(yù)組行為學(xué)評分分別為0、(6.33±1.15)、(3.67±0.58)分，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2 各組鼻粘膜病理組織變化 HE染色結(jié)果可見，與正常對照組相比較，模型組和PD-L1重組蛋白干預(yù)組的鼻粘膜上皮細胞排列紊亂，上皮層變薄，上皮細胞間連接疏松，上皮層下間質(zhì)水腫，可見散在大量嗜酸細胞為主的炎癥細胞浸潤；與模型組相比較，PD-L1重組蛋白干預(yù)組鼻粘膜上皮細胞排列較整齊，上皮層變厚，上皮細胞間連接較緊密，嗜酸細胞浸潤明顯減少(圖1)。

3 各組鼻粘膜組織PD-1、PD-L1表達變化 PD-L1通過與其受體PD-1的相互作用，介導(dǎo)免疫反應(yīng)的負性調(diào)節(jié)信號，從而誘導(dǎo)免疫抑制。在正常對照組，PD-1和PD-L1在鼻粘膜組織中高表達，并且表達在胞質(zhì)和胞漿中；在模型組中PD-1和PD-L1的的陽性細胞數(shù)明顯減少；與模型組相比較，PD-L1重組蛋白干預(yù)組中PD-1和PD-L1的陽性細胞數(shù)明顯增加(圖2)。

4 各組鼻粘膜組織p-AKT、p-mTOR、AKT、mTOR的表達 與正常對照組相比，p-AKT、p-mTOR的表達水平升高，AKT、mTOR的表達水平?jīng)]有明顯變化；與模型組相比較，p-AKT、p-mTOR的表達水平下降，AKT、mTOR的表達水平?jīng)]有明顯變化(圖3)。

5 各組鼻粘膜組織Foxp3和RORγt表達變化 Foxp3為Treg細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，RORγt為Th17細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，二者的表達水平能夠間接反映Treg/Th17的平衡變化。與正常對照組相比較，模型組和PD-L1重組蛋白干預(yù)組Foxp3表達水平顯著下降，RORγt表達水平上升；與模型組相比較，PD-L1重組蛋白干預(yù)組Foxp3表達水平上升，RORγt表達水平下降(圖4)。

圖4 RT-PCR檢測鼻粘膜組織中Foxp3和RORγt的表達

6 各組血清中IL-10、IL-17A、IL-6水平變化 與正常對照組相比較，模型組和PD-L1重組蛋白干預(yù)組血清IL-10水平下降、IL-17A、IL-6水平上升(P<0.05)；與模型組相比較，PD-L1重組蛋白干預(yù)組IL-10水平上升，IL-17A、IL-6水平下降(P<0.05)(圖5)。

圖5 ELISA檢測血清中IL-10、IL-17A、IL-6的水平(*P<0.05；與AR組比較，#P<0.05)

討 論

過敏性鼻炎是由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜I型超敏反應(yīng)。Treg和Thl7是近年來發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群。研究表明，Treg/Thl7失衡參與過敏性鼻炎的發(fā)病過程[8]。Foxp3是誘導(dǎo)CD4+T向Treg分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，分化的Treg細胞分泌IL-10和TGF-β，抑制效應(yīng)性T細胞、樹突狀細胞和單核巨嗜細胞活化，發(fā)揮免疫抑制作用[9]。Th17細胞分泌其中IL-17A與體內(nèi)廣泛表達的受體表達的IL-17受體結(jié)合，誘導(dǎo)上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等靶細胞釋放IL-8，IL-6，GM-CSF、TNF-a、CXCL1、CXCL5等前炎癥細胞因子、趨化因子，發(fā)揮促炎作用[10]。Th17細胞的分化受轉(zhuǎn)錄因子RORγt的特異性調(diào)控。

PD-1/PD-L1結(jié)合負性調(diào)控免疫反應(yīng)，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用[11]。PD-L1可通過增強誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)上Foxp3表達誘導(dǎo)Treg細胞分化，并維持其功能，PD-L1缺失導(dǎo)致體內(nèi)Treg細胞受損[12]。Sheetal等證實在雌二醇介導(dǎo)的EAE小鼠模型中，敲除PD-L1伴有Th17水平的顯著增加[13]。AKT-mTOR在調(diào)節(jié)CD4+T細胞分化過程中也發(fā)揮重要作用，激活A(yù)KT-mTOR會維持Th17細胞的穩(wěn)定和增殖，抑制Treg細胞的產(chǎn)生[14]。有研究表明[15]，抗原提呈細胞表面的PD-L1可以通過抑制T細胞中的AKT-mTOR的激活從而促進Treg細胞的分化、維持其功能。田玫[16]等亦證實，PD-L1促進子癇前期CD4+T向Treg分化，并證明通過下調(diào)p-AKT、p-mTOR來實現(xiàn)的。說明PD-L1可以通過抑制AKT-mTOR的激活促進Treg細胞的分化。基于PD-1/PD-L1在機體免疫調(diào)節(jié)中的作用，PD-1與其配體PD-L1介導(dǎo)的信號途徑正成為通過免疫干預(yù)進行臨床疾病治療的手段之一。

本研究結(jié)果顯示，PD-L1重組蛋白干預(yù)后，能有效緩解小鼠過敏性鼻炎癥狀，減輕過敏小鼠的鼻粘膜組織損傷，增加程序性死亡分子PD-1及其配體PD-L1的表達，進而增加Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達及上調(diào)Treg細胞因子IL-10水平，降低Th17轉(zhuǎn)錄因子p-AKT、p-mTOR、RORγt表達和下調(diào)細胞因子IL-17A和IL-6的水平，表明PD-L1可能通過調(diào)節(jié)Treg/Th17的比例，抑制過敏性鼻炎的發(fā)生。PD-1/PD-L1信號途徑有望成為過敏性鼻炎的治療靶點。

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(收稿：2017-11-06)

TheeffectsofPD-L1onimbalanceofTreg/Th17cellinallergicrhinitisofamurinemodel.

Wang Di,Tang Qiaofei,Jiang Yuqiu,et al.

Otolaryngology Department, Second Affiliated Hospital, Shenyang Medical College (Shenyang 110200)

Objective: To investigate the effects of PD-L1 on imbalance of Treg/Th17 cell in allergic rhinitis (AR) of a murine model. Methods: Thirty BALB/c mice were randomly divided into three groups, ten animals in each．The mice in the model group and PD-L1 recombinant protein group (PD-L1 group) received ovalbumin (OVA) to reduce allergic rhinitis．Then, The mice were intervented with recombinant PD-L1 protein. Mice in the control group were administrated normal saline. Pathological findings of nasal mucosa was analyzed by hematoxylin and eosin stain, The positive cells of PD-1 and PD-L1 in nasal mucosa was analyzed by immunohistochemistry. The expression of Foxp3 and RORγt in nasal mucosa was measured by RT-PCR. The concentration of IL-10, IL-6 and IL-17A in serum was detected by ELISA．Results:The behavioral scores for the control，model and PD-L1 groups were 0,(6.33±1.15),(3.67±0.58)respectively (allP<0.05).serious pathological damage occured in nasal mucosa in model group, whereas damage eased in PD-L1 group. Significantly decreased concentration of PD-1, PD-L1, Foxp3 in nasal mucosa and IL-10 in serum was observed in model group compared with that of the control group (P<0.05), while significantly increased expression of IL-17A, IL-6 in serum and p-AKT、p-mTOR RORγt in nasal mucosa was found (P<0.05). AKT and mTOR change non-significantly and the opposite trends for PD-L1 group compared with the model group(P<0.05). Conclusion: PD-L1 may inhibited AR by inhibiting AKT-mTOR signal pathway and then promoting the differentiation of Treg cells．

Rhinitis,allergic，seasonal/immunology @Recombinant proteins @Regulatory T cells Th17 cells Mice

鼻炎,過敏性，季節(jié)性/免疫學(xué) 重組蛋白質(zhì)類 @調(diào)節(jié)性T細胞 Th17細胞 小鼠

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.004