SRSF1和BIRC5在胃癌組織中的表達及臨床意義

李曉春，郝銀恒，柳長明

1.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007； 2.河南科技大學第二附屬醫(yī)院，河南 洛陽 471000； 3.深圳市第七人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000

胃癌(gastric cancer)是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家胃癌發(fā)生率比較高，占世界胃癌總發(fā)生率的67%左右[1]。如今人們認識到胃癌同其他惡性腫瘤一樣是一種分子疾病，因此，從凋亡途徑來探究胃癌的發(fā)生與發(fā)展具有一定的研究價值。具有腫瘤特異性的凋亡抑制基因家族成員BIRC5一般情況下只表達于腫瘤組織和胚胎組織[2-3]，資料顯示，胃癌腫細胞中BIRC5呈現(xiàn)上調(diào)表達，而在正常分化組織中幾乎不表達，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有著密不可分的關(guān)系[4]。人絲氨酸/精氨酸富有剪接因子1(serine/arginine rich splicing factor 1，SRSF1)是SR蛋白家族的原型成員，它亦是一種原癌蛋白，在乳腺癌、白血病及肺癌等惡性腫瘤的患者體內(nèi)中呈現(xiàn)過表達現(xiàn)象[5]。學者認為，SRSF1之所以參與多種復雜的生物學通路取決于其對前體mRNA的選擇性剪接與加工、胞內(nèi)定位與運輸?shù)壬磉^程，從某種程度上控制著下游相關(guān)蛋白的表達程度及功能的發(fā)揮。研究表明，SRSF1與BIRC5在前列腺癌腫組織中均有高表達，BIRC5蛋白表達量的升高與SRSF1蛋白表達量的升高呈正相關(guān)[6]；然而關(guān)于SRSF1和BIRC5在胃癌中表達的相關(guān)研究很少，本研究旨在通過RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測兩基因在胃癌腫組織及其癌旁組織中的表達情況，進而探究兩者與胃癌發(fā)生、發(fā)展之間可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般材料 留取60例2016年5月至2017年5月于我院(佳木斯大學第一附屬醫(yī)院)普通外科進行胃癌切除患者的癌腫標本及其相應(yīng)的癌旁組織，留取的癌旁組織距離其癌腫邊緣均大于50 mm。標本均存儲于液氮中備用。本研究始終遵循中華醫(yī)學倫理委員會制定的倫理標準，患者術(shù)前通過影像學檢查、血液學檢查均未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)惡性腫瘤，術(shù)前未行放療、化療、射頻治療及免疫治療，術(shù)中所選標本病理回報確認為胃癌。60例胃癌患者的胃癌標本中，男性32例，女性28例；年齡在40～86歲，平均59.7歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期23例；術(shù)中證實有淋巴轉(zhuǎn)移者15例，否認淋巴轉(zhuǎn)移者45例。

1.2檢測方法

1.2.1實驗試劑 鼠抗人單克隆SRSF1抗體及β-actin抗體(購自福建邁新)，BIRC5、SRSF1及內(nèi)參引物(Bioengineering公司合成)。提取RNA Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGENE公司，Germany)，Taq DNA聚合酶及dNTPs購自TaKaRa。BIRC5(sc-101432)、SRSF1(sc-33652)抗體、Actin(sc-10731)及HRP標記的羊抗鼠二抗(sc-2005)購自Santa Cruz。ECL Plus western blotting detection reagents(RPN2132，GE，Piscotoway，NJ，USA)，X光膠片(Eastman Kodak Co.)。

1.2.2總RNA提取 參照miRNeasy Mini Kit提供的說明書進行mRNA和microRNA的總RNA提取。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) SRSF1 mRNA、BIRC5 mRNA cDNA，均采用Invitrogen的SuperScriptTMFirst-strand Synthesis System進行合成，引物為oligo-dt。采用Invitrogen的SuperScriptTMII試劑盒，嚴格按照說明書步驟操作mRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。將所有產(chǎn)物存儲于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4半定量PCR法 參照文獻[7]BIRC5及SRSF1的PCR擴增，應(yīng)用miScript SYBR Green PCR試劑盒三步法。SRSF1擴增時無需加入miScript通用引物。BIRC5及SRSF1的PCR擴增引物：SRSF1 sense：5′-CGTTGAGTTCGAGGACC-CG-3′，SRSF1 Anti-sense：5′-TAACCCGGATGT-AGGCAG-3′，BIRC5 sense：5′-ATGGGTGCCCC-GACGT-3′，BIRC5 Antisense：5′-ACAGCAGTG-AGTCTGTC-3′，內(nèi)參為β-actin：Sense：5-CTGA-CAGACTACCTCATGAAG-3，Antisense：5-TCA-ATCCATGGCAGC-3，反應(yīng)條件：預變性94℃、5 min；變性94℃、30 s，退火60℃、30 s，72℃、30 s，延伸72℃、7 min，30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測最終產(chǎn)物。

1.2.5應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測SRSF1及BIRC5蛋白表達強度 參照說明書的提示提取組織總蛋白，完成蛋白濃度測定：取50 μg蛋白，與6×loading buffer混合后，65℃水浴10 min。12% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)PVDF膜上，PVDF膜在5%脫脂奶粉35℃封閉60 min。經(jīng)TBST充分洗膜后，與anti-SRSF1抗體(1∶500)，anti-BIRC5 antibody(1∶400)室溫孵育60 min，TBST buffer洗膜3次，共15 min，與HRP標記的二抗室溫孵育60 min，TBST buffer充分漂洗3次，每次5 min。采用ECL plus western blotting detection reagents使膠片進行曝光。以β-actin作為內(nèi)參照，SRSF1/β-actin比值、BIRC5/β-actin即為蛋白表達強度。

2 結(jié) 果

2.1SRSF1和BIRC5在胃癌腫組織中的表達情況及臨床病理特征之間的關(guān)系 在胃癌腫組織中SRSF1的表達情況：SRSF1陽性表達率為75.0%(45/60)，明顯高于其癌旁組織的8.3%(5/60)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=46.5103，P=0.000)；BIRC5 mRNA的表達情況：BIRC5陽性表達率為81.7%(49/60)，高于癌旁組織中的11.7%(7/60)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=39.1152，P=0.000)；胃癌腫組織中SRSF1 mRNA與BIRC5 mRNA的陽性表達盡管與其患者所處的年齡階段、性別差異以及腫瘤大小等因素無關(guān)，但是癌腫組織的分化程度、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及TNM分期都與之有著密不可分的關(guān)聯(lián)(見圖1、圖2，表1)。

N1、N2、N3:癌旁組織，C1、C2、C3:癌組織；胃癌組織和癌旁組織中SRSF1統(tǒng)計學分析：胃癌組織/癌旁組織=3.3倍

圖1胃癌患者SRSF1 mRNA表達分析

N1、N2、N3:癌旁組織，C1、C2、C3:癌組織；胃癌組織和癌旁組織中BIRC5統(tǒng)計學分析：胃癌組織/癌旁組織=2.48倍

圖2 胃癌患者BIRC5 mRNA表達分析

2.2SRSF1和BIRC5在胃癌組織中的關(guān)系 在存留的60例胃癌標本中，SRSF1表達陽性的有45例，陰性15例；BIRC5表達陽性者49例，陰性11例；同一標本中兩者均呈陽性者有41例，陰性的有6例。SRSF1與BIRC5在胃癌腫組織中的陽性表達正相關(guān)(r=0.3496，P=0.006<0.01)，見表2。

表2 胃癌中SRSF1和BIRC5之間的關(guān)系

2.3SRSF1和BIRC5蛋白相對表達水平 在胃癌腫組織及對應(yīng)癌旁組織內(nèi)均可見SRSF1和BIRC5的蛋白條帶；檢測分析其蛋白條帶灰度值后可見：胃癌腫組織中SRSF1的蛋白表達量相較于癌旁組織中蛋白的表達量明顯增高(t=44.87，P<0.01)；BIRC5蛋白在胃癌腫組織中表達量同樣比其在癌旁組織中的蛋白表達量高(t=69.34，P<0.01)；(圖3、圖4，表3)。

SRSF1蛋白表達分析(內(nèi)參β-actin)， N1、N2、N3:癌旁組織；C1、C2、C3:胃癌組織；胃癌組織和癌旁組織中SRSF1統(tǒng)計學分析：；胃癌組織/癌旁組織=3.08倍

圖3胃癌患者SRSF1蛋白表達分析

BIRC5蛋白表達分析(內(nèi)參β-actin)， N1、N2、N3:癌旁組織；C1、C2、C3:胃癌組織；胃癌組織和癌旁組織中SRSF1統(tǒng)計學分析；胃癌組織/癌旁組織=1.73倍

圖4 胃癌患者BIRC5蛋白表達分析

3 討 論

3.1研究結(jié)果 實驗結(jié)果顯示，在胃癌腫組織中SRSF1、BIRC5兩基因的表達相較于其癌旁組織均表現(xiàn)出異常增高，兩者存在正相關(guān)。臨床病理特征統(tǒng)計表明，胃癌腫組織中SRSF1 mRNA與BIRC5 mRNA的陽性表達雖然與其患者所處的年齡階段、性別差異以及腫瘤大小等因素無關(guān)，但是與其癌腫組織的分化程度、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)，進一步證明了SRSF1與BIRC5的高表達有著促進胃癌發(fā)生、發(fā)展的功能。

資料顯示，SRSF1過表達是導致腫瘤發(fā)生的重要因素[8-11]，其調(diào)節(jié)可變剪接事件已被證實有助于腫瘤發(fā)生[11]。過表達的SRSF1在Wnt-β-catnin信號通路中，是通過促進基因剪接形成抗凋亡亞型，抑制細胞凋亡。SRSF1可以增強蛋白翻譯激活因子的磷酸化或者抑制蛋白翻譯的抑制因子這兩種方式同時促進細胞增殖[2,12]。學者發(fā)現(xiàn)，SRSF1是通過調(diào)節(jié)細胞的凋亡程序，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，然而細胞的凋亡抑制則是促進腫瘤迅速發(fā)生、發(fā)展的主要因素之一[6]。因此，不難斷定在正常組織細胞突變成異常增生細胞的過程中與細胞的凋亡抑制有著密不可分的聯(lián)系。BIRC5是凋亡抑制基因家族中新近發(fā)現(xiàn)的成員，在抑制細胞凋亡方面效果顯著，查閱基因庫可知BIRC5參與了人類多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。從組織分布上來看BIRC5通常表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，對于成人而言除胸腺、生殖腺外其他組織器官未見表達[13]。在腫瘤組織中 BIRC5呈現(xiàn)陽性表達，這與BIRC5是目前已知的作用較強的凋亡抑制蛋白有關(guān)[2-3]。有研究顯示SRSF1與BIRC5在前列腺癌腫組織中同時呈現(xiàn)高表達，并且BIRC5蛋白表達量的升高與SRSF1蛋白表達量的升高呈正相關(guān)[6]，可能與細胞凋亡的信號通路中斷有關(guān)。目前，死亡受體途徑和線粒體途徑是細胞凋亡的兩條主要途徑，兩者均需要通過激活下游的效應(yīng)因子caspase-3及caspase-7來聯(lián)通信號通路，BIRC5蛋白則是直接粘附于活化的caspase-3、caspase-7上，使其不能發(fā)揮效能，信號通路由此中斷[3,14]。推測胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能與過表達的SRSF1通過上調(diào)BIRC5的表達來阻斷細胞凋亡信號通路有關(guān)。

3.2研究意義 實驗證實了SRSF1和BIRC5基因的高表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在胃癌腫組織中SRSF1的高表達是促進凋亡抑制基因BIRC5高表達的一個因素，這為我們通過干預SRSF1的表達進而影響凋亡抑制因子BIRC5的表達來治療及預防胃癌復發(fā)提供了理論基礎(chǔ)以及實驗依據(jù)。

3.3創(chuàng)新性 近年來從細胞凋亡途徑來探討腫瘤發(fā)病機制的研究屢見不鮮，然而將選擇性剪接因子SRSF1與凋亡抑制因子BIRC5聯(lián)系在一起應(yīng)用于胃癌的研究則是屈指可數(shù)，該實驗填充了這方面的空缺。

3.4不足與展望 由于實驗條件的限制我們選取的標本數(shù)量少，這意味著實驗結(jié)論不一定適合于所有胃癌患者，因此在后續(xù)的研究中還需通過對臨床上大量胃癌標本的研究來驗證實驗結(jié)論。通過SRSF1和BIRC5的深入研究有望使其成為胃癌早期診斷的新標準，并且為臨床上治療及預防胃癌的復發(fā)提供新靶點。

[1] Zheng S. Review and current status of gastric cancer research in the past 30 years[J]. J Pract Oncol, 2016, 1(1): 2-4.

[2]Zhang J, Li F, Liu X, et al. The repression of human differentiation related gene BIRC5 expression by Myc via Miz-1-dependent interaction with the BIRC5 core promoter[J]. J Biol Chem, 2006, 281(51): 39159-39168.

[3]Shaw RJ, Cantley LC. Ras, P(3)K and mTOR signalling controls tumour cell growth[J]. Nature, 2006, 441(7092): 424-430.

[4]Moulton VR, Gillooly AR, Tsokos GC. Biquitination regulates expression of the serine/arginine-rich splicing factor 1(SRSF1)in normal and systemic lupus erythematosus(SLE)T cells[J]. J Biolog Chem, 2014, 289(7): 4126-4137.

[5]Mavrou A, Brakspear K, Hamdollah-Zadeh M, et al. Serine-arginine protein kinase 1(SRPK1)inhibition as a potential novel targeted therapeutic strategy in prostate cancer[J]. Oncogene 2015, 34(33): 4311-4319.

[6]Parsons DW, Wang TL, Samuels Y, et al. Colorectal cancer: Mutations in a signalling pathway[J]. Nature, 2005, 436(7052): 792.

[7]LAN Hongbo, PAN Jie, LU Xingrong, et al. Expression and clinical significance of miR-196b, mRNA and HoxB8 mRNA in gastric cancer tissues[J]. J Clin & Basic China Surg, 2013, 20(4): 400-405. (in Chinese)

蘭鴻波, 潘杰, 盧星榕, 等, miR-196b, mRNA 和HoxB8 mRNA在胃癌中的表達及臨床意義[J]. 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2013, 20(4): 400-405.

[8]Tong JH, Sun Z, Wang ZN, et al. Early gastric cancer with sig-net-ring cell histologic type: Risk factors of lymph node metasta-sis and indications of endoscopic surgery[J]. J Surg, 2011, 96(33): 753.

[9]R?del F, Reichert S, Sprenger T, et al. The role of survivin for radiation oncology: Moving beyond apoptosis inhibition[J]. Curr Med Chem, 2011, 18(2): 191-199.

[10] Hu XL, Plescia J, Clevers H, et al. Expression analysis of the BIRC5 gene in mouse embryonic and adult tissues[J]. Cell Tissue Res, 2006, 325(1): 67-76.

[11] Deng Y, Yao L, Chau L, et al. N-Myc downstream-regulated gene 2(BIRC5) inhibits glioblastoma cell proliferation[J]. Int J Cancer, 2003, 106(3): 342-347.

[12] Migheli F, Migliore L. Epigenetics of colorectal cancer[J]. Clin Genet, 2012, 81(4): 312-318.

[13] Okuda T, Kondoh H. Identification of new genes ndr2 and ndr3 which are related to Ndr1/RTP/Drg1 but show distinct tissue specificity and response to N-myc[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999. 266(1): 208-215.

[14] Jin Q, Menter DG, Mao L, et al. Survivin expression in normal human bronchial epithelial cells an early and critical step in tumori genesis induced by tobacco exposure[J]. Carcinogenesis, 2008, 29(8): 1614-1622.