甘肅鼢鼠甘油三酯脂酶基因(ATGL)CDS克隆及組織表達分析

范佳敏，鄭雪莉，韓崇選，李 琦，卜書海*

(1.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西 楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊陵 712100)

甘肅鼢鼠(Myospalaxcansus，以下簡稱“鼢鼠”)隸屬于嚙齒目(Rodentia)倉鼠科(Cricetidae)，主要分布于黃土高原，終年棲居地下，通過挖掘洞道系統(tǒng)啃食植物的地下根、莖，其危害的寄主植物多達95種，在林區(qū)主要危害油松(Pinustabulaeformis)、落葉松(Larixgmelinii)、側(cè)柏(Platycladusorientalis)、刺槐(Robiniapseudoacacia)等造林樹種，嚴重影響苗木的成活率及保存率，制約西北、華北地區(qū)林業(yè)生態(tài)建設的發(fā)展[1-3]。挖掘習性及洞道內(nèi)低氧高二氧化碳且較為封閉的特殊環(huán)境使鼢鼠形成了一系列適應地下生活且有別于地面鼠的特征，包括能量代謝方面的差異[4-5]。長期挖掘、建造洞道是一項高耗能的過程，且能夠使呼吸速率升高產(chǎn)生較多的熱量[6-7]。也有研究指出，洞道的封閉性導致地下鼠基礎代謝率低于地面鼠[8]。目前對鼢鼠的研究主要集中于生態(tài)、行為、防治、組織結(jié)構(gòu)和低氧適應機制等方面，未見關(guān)于其能量代謝方面的報道，其高耗能挖掘過程中的能量供應方式也不可知。闡明其適應地下生活的能量代謝方式有助于加深對鼢鼠生活習性的了解，有利于從多方面對其進行防治。

脂肪組織是脊椎動物最重要的能量庫，主要以甘油三酯(triglyceride,TG)的形式儲存能量，其水解過程是機體主要的能量來源。甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)屬于非鈣依賴磷酸酯酶蛋白家族，具有轉(zhuǎn)?；钚裕商禺愋缘卮呋┠芪镔|(zhì)TG的第一酯鍵發(fā)生水解[9]，因此被認為是脂解作用的限速酶，其活性直接關(guān)系到機體能量代謝的正常進行[10]。在體內(nèi)超表達ATGL基因，脂肪細胞水解能力增加；而抑制ATGL基因表達，脂肪細胞酰基水解酶活性急劇下降[11]。ATGL基因?qū)Ψ侵炯毎闹|(zhì)代謝也具有調(diào)節(jié)作用，其表達水平與脂滴體積大小顯著相關(guān)[12]。也有研究表明，小鼠ATGL遺傳失活會導致TG在多個組織中大量積累；小鼠應對冷刺激的能力下降[10]。另外，大鼠禁食后不同部位白色脂肪組織中ATGL基因mRNA表達水平上升，其對長時間禁食后維持低水平FFA動員起著關(guān)鍵作用[13-14]。上述研究均表明，ATGL在機體脂質(zhì)分解、能量代謝中發(fā)揮重要作用。關(guān)于ATGL的研究主要集中于畜禽類或小鼠、大鼠等模式動物，在地下鼠中研究相當少見，目前鼢鼠ATGL基因序列還未知，且該基因在鼢鼠各組織中的表達規(guī)律也未見報道。

基于此，本研究將鼢鼠作為研究對象，旨在克隆其ATGL基因CDS，并分析其mRNA在不同組織中的表達情況，為進一步闡明鼢鼠能夠適應地下生活的能量代謝方式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用動物與組織采集

試驗用甘肅鼢鼠均采用陷阱法捕自寧夏省固原市，4只均為雄性成年個體。折頸法處死后采集其棕色脂肪、皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、肝、心臟、肌肉、脾和腎等8個組織樣品，于液氮中速凍，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑、T載體克隆試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自寶生物工程有限公司(TaKaRa，中國大連)；凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒小提試劑盒均由OMEGA公司提供(OMEGA，美國)；大腸桿菌(E.coli)DH5α菌株為實驗室保存；低溫高速離心機由Eppendorf公司生產(chǎn)(Eppendorf，德國)；Nannodrop定量儀由Gene公司生產(chǎn)(Gene，美國)；基因擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)與實時定量PCR儀均由Bio-Rad公司生產(chǎn)(Bio-Rad，美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 鼢鼠各組織RNA提取和cDNA合成 采用Trizol法提取RNA，具體步驟按照試劑盒(TaKaRa，大連)說明書進行。用DEPC水溶解RNA沉淀，分別采用核酸定量檢測儀及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度、濃度及完整性。-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)TakaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，合成cDNA第1鏈，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鼢鼠ATGL基因CDS克隆與測序 參照小鼠與小鼴形鼠ATGL基因序列(小鼠GenBank登錄號：NM_001163689.1；小鼴形鼠GenBank登錄號：XM_008854416.2)，采用Primer Premier 5.0軟件及NCBI中Primer-BLAST程序設計3對引物擴增鼢鼠ATGL基因的不同區(qū)域(表1)，3對引物擴增所得產(chǎn)物之間均有重疊區(qū)域(圖1)，引物均由Invitrogen公司合成。

以內(nèi)臟脂肪組織cDNA為模板進行PCR反應，引物為表1中的AT1、AT2、AT3，反應體系為10 μL：2×Premix Taq 5 μL，cDNA 1～2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，加去離子水至10 μL。擴增條件為：95℃預變性3 min；95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃后延伸10 min；4℃結(jié)束反應。

所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，于氨芐培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選，挑選陽性克隆擴繁，送Invitrogen公司測序檢測目的序列。

表1 鼢鼠ATGL基因克隆與實時熒光定量PCR引物信息

注：GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

注：CDS序列全長1 461 bp，1、2、3分別表示使用引物AT1、AT2和AT3擴增的產(chǎn)物。

圖1鼢鼠ATGL基因CDS序列PCR擴增示意圖

Fig.1 Schematic diagram of the PCR strategy for Gansu zokorATGLgene CDS cloning

1.3.3 鼢鼠ATGL基因生物信息學分析 采用NCBI、DNAStar等生物信息學網(wǎng)站及軟件進行測序結(jié)果比對和拼接；采用ExPaSy(http://www.expasy.org/tools/)程序推導ATGL基因 CDS所編碼的氨基酸序列，并分析ATGL理化性質(zhì)及預測其二級結(jié)構(gòu)[15]；采用NCBI中BLAST程序及The Sequence Manipulation Suite(SMS,http://www.bio-soft.net/sms/)程序進行序列相似性比對分析；采用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[16]；采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預測ATGL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型[15]；采用NCBI中CDD分析ATGL蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。

1.3.4 鼢鼠ATGL基因組織表達分析 根據(jù)鼢鼠ATGL基因和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank登錄號：AF036934.1)序列設計qRT-PCR引物(表1)。qRT-PCR反應體系為：SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA1 μL，加去離子水至10 μL。反應條件為：95℃預變性1 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)；反應結(jié)束后進行溶解曲線分析驗證產(chǎn)物特異性：55℃、30 s進行81個循環(huán)。自動采集熒光信號。每個樣品進行4次技術(shù)重復。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 以鼢鼠腎組織ATGL基因的表達量為1，將GAPDH基因作為內(nèi)參，采用Ct法(Qr=2-ΔΔCt,ΔCt=CtATGL-CtGAPDH)計算分析鼢鼠各組織中ATGL基因mRNA的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼢鼠ATGL基因CDS克隆

以鼢鼠內(nèi)臟脂肪組織cDNA為模板，AT1、AT2、AT3為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，3對引物經(jīng)特定反應均可產(chǎn)生PCR擴增產(chǎn)物(圖2)，且目標條帶清晰，大小與預期相符，回收片段，克隆測序。測序分別得到長為603、740 bp和561 bp的序列，去重疊拼接后將該序列與小鼠ATGL基因進行比對，結(jié)果顯示，兩者核苷酸序列相似性高達89 %，確定該序列為鼢鼠ATGL基因。鼢鼠ATGL基因CDS序列全長1461 bp，編碼486個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA(圖3)。將所得序列提交至GenBank，登錄號為KY030728。

注：PCR模板為內(nèi)臟脂肪組織cDNA；1、2、3分別代表AT1、AT2、AT3 PCR產(chǎn)物；M：DL 2 000 DNA分子標記。

注：氨基酸序列由ExPASy程序推導；下劃線的ATG為起始密碼子；星號部分的TGA為終止密碼子；灰色陰影部分為Patatin結(jié)構(gòu)域；方框內(nèi)為“GXSXG”模序。

圖3鼢鼠ATGL基因部分cDNA序列及推導的氨基酸序列

Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequence of part of the cDNA of Gansu zokorATGLgene

2.2 鼢鼠ATGL基因生物信息學分析

2.2.1 鼢鼠ATGL基因序列相似性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 采用BLAST程序?qū)⒖寺〉玫降镊魇驛TGL基因CDS序列與GenBank中收錄的11個不同物種的ATGL進行比對，結(jié)果表明，鼢鼠ATGL基因與其他物種相似性較高(表2)。其中，鼢鼠ATGL核苷酸序列與小鼴形鼠的相似性最高，為92.95 %；其編碼的氨基酸序列與中國倉鼠的相似性最高，為95.47%。依據(jù)不同物種的ATGL氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)，結(jié)果表明，鼢鼠ATGL與中國倉鼠、小鼠和大鼠的親緣關(guān)系較近。

表2 鼢鼠與其他物種ATGL基因相似性分析

2.2.2 鼢鼠ATGL的理化性質(zhì) 鼢鼠ATGL基因共編碼486個氨基酸，N端為蛋氨酸(Met)，分子式為C2382H3803N669O695S26，相對分子質(zhì)量53 767.02，理論等電點為6.68。構(gòu)成該蛋白質(zhì)的各氨基酸中，亮氨酸(Leu)含量最高，為13.4%，丙氨酸(Ala)和脯氨酸(Pro)含量次之，均為8.2%。帶正電(Arg+Lys)和帶負電(Asp+Glu)的總殘基數(shù)分別為48和50，總平均親水性(GRAVY)為-0.129，脂溶指數(shù)為93.95，在哺乳動物體外半衰期為30 h，其不穩(wěn)定系數(shù)為54.41，為不穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 鼢鼠ATGL的分子結(jié)構(gòu) 鼢鼠ATGL二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲為主。共有175個氨基酸殘基參與了20個α-螺旋的形成，占36.01%，53個氨基酸殘基參與了13個β-折疊的形成，占10.91%，其余氨基酸殘基參與無規(guī)卷曲的形成(圖5A)。蛋白質(zhì)生物學功能正確行使與否很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)，其不同構(gòu)象導致生物學功能多樣。通過SWISS-MODEL預測得到的三維結(jié)構(gòu)顯示，鼢鼠ATGL蛋白空間結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主(圖5B)。與其他物種ATGL相似，鼢鼠ATGL蛋白N端也存在1個保守的Patatin結(jié)構(gòu)域(圖3，圖5C)，并且在其AA45～AA50間存在具有酯酶活性的氨基乙酸-丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸-氨基乙酸(GASAG)結(jié)構(gòu)，其中位于第47位的絲氨酸與該蛋白催化活性相關(guān)。

注：采用MEGA 6.0 軟件、鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，0.05代表遺傳距離。

注：5A：ExPASy預測ATGL蛋白二級結(jié)構(gòu)，“h”表示α-螺旋，“e”表示β-折疊，“c”表示無規(guī)卷曲；5B：SWISS-MODEL預測ATGL蛋白三級結(jié)構(gòu)；5C：NCBI預測ATGL氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域。

圖5鼢鼠ATGL蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域預測

Fig.5 Prediction of the secondary structure,three dimensional structure and conserved domain of Gansu zokor ATGL

2.3 鼢鼠ATGL基因組織表達分析

將鼢鼠GAPDH作為內(nèi)參基因，經(jīng)qRT-PCR反應，所得溶解曲線均為單峰，說明定量引物的特異性良好，未產(chǎn)生非目的熒光干擾試驗結(jié)果，因此該數(shù)據(jù)可真實反映ATGL基因在各組織中的相對表達量。結(jié)果表明，ATGL基因在被檢測的8個組織中均有表達，其表達量由高到低依次為棕色脂肪組織、皮下脂肪組織、肝臟、內(nèi)臟脂肪組織、心臟、脾、肌肉和腎。其中，棕脂中ATGL基因的表達水平顯著高于其他組織(P<0.05)，其表達量是皮下脂肪的9.3倍、肝臟的15倍；腎中ATGL基因表達水平最低(圖6)。

注：采用qRT-PCR檢測ATGL基因在不同組織中的相對表達量，GAPDH為內(nèi)參基因；1～8：腎、肌肉、脾、心臟、內(nèi)臟脂肪組織、肝臟、皮下脂肪組織和棕色脂肪組織；*表示差異顯著，P<0.05；n=4。

圖6鼢鼠ATGL基因在不同組織中的表達量分析

Fig.6 The relative expression level of Gansu zokorATGLgene in various tissues

3 結(jié)論與討論

ATGL是近年來新發(fā)現(xiàn)的啟動脂肪動員的關(guān)鍵酶，在脂質(zhì)分解、能量代謝中發(fā)揮重要作用，與其相關(guān)研究一直備受關(guān)注，但主要集中于畜禽或模式動物，在地下鼠中相當少見。本研究克隆了鼢鼠ATGL基因的CDS序列，該區(qū)全長1 461 bp，編碼486個氨基酸，蛋白分子式為 C2382H3803N669O695S26，相對分子質(zhì)量53 767.02，為進一步豐富ATGL基因功能、研究鼢鼠適應地下生活的能量代謝方式奠定基礎。

序列比對結(jié)果顯示，鼢鼠ATGL氨基酸序列與小鼴形鼠、中國倉鼠、小鼠、大鼠、人、豬、牛等哺乳動物相比具有較高的相似性(81%以上)，與雞和大黃魚相比，其氨基酸序列相似性分別為68.49%和59.55%。當序列一致性>40%，蛋白質(zhì)功能變異很少見[17]。較高的序列相似性預示著該基因在不同物種中行使功能相似，充分說明ATGL功能在進化中高度保守。將大黃魚作為外群構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，人、牛、小鼠、鼢鼠等哺乳動物處于同一分支，雞處于另一分支，且在哺乳動物中，嚙齒動物聚為一支，這與脊椎動物進化關(guān)系相吻合。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹是通過序列相似性推斷功能相似性最經(jīng)典的方法，由圖4可知，鼢鼠ATGL基因與中國倉鼠、小鼠和大鼠這3個物種的親緣關(guān)系較近，功能更相似。

與其他物種相似，鼢鼠ATGL蛋白N端含有1個Patatin結(jié)構(gòu)域，并且存在具有酯酶活性的GASAG結(jié)構(gòu)。含有Patatin結(jié)構(gòu)域的蛋白在生物界廣泛存在，原核、真核生物中均有發(fā)現(xiàn)[18-19]，但功能卻相差很大。植物根、莖中的Patatin蛋白與營養(yǎng)物質(zhì)的儲存相關(guān)[20]，而在動物體內(nèi)則與免疫相關(guān)，廣泛的物種性說明該結(jié)構(gòu)域具有很高的同源性。該結(jié)構(gòu)域可以作用于磷脂、甘油一酯和甘油二酯，且具有?；饷负王ッ富钚訹21]。GXSXG(氨基乙酸-X-絲氨酸-X-氨基乙酸)是脂肪酶的特征性結(jié)構(gòu)域，絲氨酸為其活性位點，催化脂解反應的進行。這進一步說明ATGL基因在鼢鼠脂質(zhì)水解和能量代謝中占有重要地位。

ATGL基因在多種動物體中均有表達。R.Zimmermann[11]、J.A.Villena[22]、Shan T[24]、崔歡歡[24]、滕炎玲[26]、Nie Q[23]等分別以小鼠、豬、牛、羊、雞為研究對象檢測不同組織中ATGL基因表達情況發(fā)現(xiàn)該基因在被檢測組織中幾乎均有表達，且在脂肪組織中表達量最高。本研究結(jié)果表明，鼢鼠ATGL基因在8個被檢測組織中均有表達，且在棕脂中表達量最高，其次為皮下脂肪、肝和內(nèi)臟脂肪組織，而其他組織中表達較少，這與小鼠、豬、牛、羊、雞的表達模式基本一致，即均在脂肪代謝活躍的組織中高表達。ATGL在被檢組織中均有表達，說明在能量消耗時，絕大多數(shù)組織均可水解組織自身儲存的TG供能，但其能量儲存較少，主要的能量仍需脂肪組織水解提供。大量研究表明，白色脂肪組織水解主要為各組織、器官提供能量，而棕脂水解則與解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein 1,UCP1)的激活和適應性產(chǎn)熱相關(guān)[27-28]，且冷刺激可以促進棕脂中脂肪消耗[29]。G.Haemmerle[10]和M.Ahmadian[27]等還發(fā)現(xiàn)ATGL基因?qū)τ谧厣窘M織表型的維持是必須的。ATGL基因在鼢鼠棕脂中表達量顯著高于其他組織，表明棕脂對于鼢鼠能量代謝有重要意義。鼢鼠野外生存環(huán)境多變，且沒有穩(wěn)定的食物來源，在應對寒冷、休眠和營養(yǎng)不足等刺激時，棕脂有助于維持體溫從而保護機體免受低溫傷害。由此可見，棕色脂肪組織對于野生動物野外生存非常必要，對于提高動物對環(huán)境驟變的適應能力和擴大動物生態(tài)位意義重大。

本研究克隆得到鼢鼠ATGL基因CDS序列，并在此基礎上進行序列分析、ATGL蛋白結(jié)構(gòu)預測以及組織表達分析，結(jié)果表明，ATGL功能在進化中高度保守，其在鼢鼠脂質(zhì)水解和能量代謝中發(fā)揮重要作用，且棕脂對于鼢鼠野外生存意義重大。本研究為進一步研究鼢鼠適應地下生活的能量代謝方式及ATGL基因在地下鼠能量代謝中的作用機制提供基礎資料。

參考文獻:

[1] 安永平,郎杏茹,李繼光,等.寧夏固原市甘肅鼢鼠生物學習性研究[J].中國森林病蟲,2007,26(5):29-30.

AN Y P,LANG X R,LI J G,etal.Biological habit ofMyospalaxcansusin Guyuan of Ningxia Hui Autonomous Region[J].Forest Pest and Disease,2007,26(5):29-30.(in Chinese)

[2] 韓崇選,楊學軍,王明春,等.林區(qū)鼢鼠的綜合管理研究[J].西北林學院學報,2002,17(3):53-57.

HAN C X,YANG X J,WANG M C,etal.The integrated pest management of zoker in forest area[J].Journal of Northwest Forsstry University,2002,17(3):53-57.(in Chinese)

[3] 王明春,韓崇選,楊學軍,等.林區(qū)甘肅鼢鼠危害的主要特征及生態(tài)控制對策[J].西北林學院學報,2004,19(3):105-108.

WANG M C,HAN C X,YANG X J,etal.Harmfulness characteristic and bionomic control measurements to Gansu zokor in plantation areas[J].Journal of Northwest Forsstry University,2004,19(3):105-108.(in Chinese)

[4] 鄭燕燕,李金鋼.地下鼠的地下適應性特征及其行為對策[J].安徽農(nóng)學通報,2008,14(9):38-41.

ZHENG Y Y,LI J G.Subterranean adaptability characteristics and behavior countermeasures of subterranean rodents[J].Anhui Agricultural Science Bulletin,2008,14(9):38-41.(in Chinese)

[5] 張小剛,麻安衛(wèi),張衛(wèi)國,等.地下嚙齒動物的生存環(huán)境及對代謝的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2017(2):219-222.

[6] VLECK D.The energy cost of burrowing by the pocket gopherThomomysBottae[J].Physiological and Biochemical Zoology,1979,52(2):122-136.

[7] CUTRERA A P,ANTINUCHI C D,MORA M S,etal.Home-range and activity patterns of the South American subterranean rodent Ctenomys talarum[J].Journal of Mammalogy,2006,87(6):1183-1191.

[8] LUNA F,ANTINUCHI C D.Energy and distribution in subterranean rodents:Sympatry between two species of the genus Ctenomys[J].Comparative Biochemistry & Physiology Part A Molecular & Integrative Physiology,2007,147(4):948-954.

[9] LAKE A C,SUN Y,LI J L,etal.Expression,regulation,and triglyceride hydrolase activity of Adiponutrin family members[J].Journal of Lipid Research,2005,46(11):2477-2487.

[10] HAEMMERLE G,LASS A,ZIMMERMANN R,etal.Defective lipolysis and altered energy metabolism in mice lacking adipose trigly ceride lipase[J].Science,2006,312(5774):734-737.

[11] ZIMMERMANN R,STRAUSS J G,HAEMMERLE G,etal.Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase[J].Science,2004,306(57):1383-1386.

[12] SMIRNOVA E,GOLDBERG E B,MAKAROVA K S,etal.ATGL has a key role in lipid droplet/adiposome degradation in,mammalian cells[J].EMBO Reports,2006,7(1):106 -113.

[13] CAIMARI A,OLIVER P,PALOU A.Impairment of nutritional regulation of adipose triglyceride lipase expression with age[J].International Journal of Obesity,2008,32(8):1193-1200.

[14] BERTILE F,RACLOT T.ATGL and HSL are not coordinately regulated in response to fuel partitioning in fasted rats[J].Journal Nutritional Biochemistry,2011,22(4):372-379.

[15] GASTEIGER E,HOOGLAND C,GATTIKER A,etal.Protein identification and analysis tools on the ExPASy Server[M].New York:The proteomics Protocols Handbook Humana Press,2005:571-607

[16] TAMURA K,PETERSON D,PETERSON N,etal.MEGA5:molecular evolutionary genetic analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods[J].Molecular Biology and Evolution,2011,28(10):2731-2739.

[17] TODD A E.Evolution of function in protein superfamilies[J].Journal of Molecular Biology,2001,307(4):1113 -1143.

[18] BANERJI S,FLIEGER A.Patatin-like proteins:a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?[J].Microbiology,2004,150(3):522-525.

[19] SATO H,FRANK D.ExoU is a potent intrace-llular phospholipase[J].Molecular Microbiology,2004,53(5):1279-1290.

[20] SHEWRY P R.Tuber storage proteins [J].Annals of Botany，2003，91(7)：755-769.

[21] BATEMAN A,COIN L,DURBIN R,etal.The pfam protein families database[J].Nucleic Acids Research,2004,32(Database issue):263-266.

[22] VILLENA J A,ROY S,SARKADI-NAGY E,etal.Desnutrin,an adipocyte gene encoding a novel patatin Domain-containing protein,is induced by fasting and glucocorticoids:ectopic expression of desnutrin increases triglyceride hydrolysis[J].Journal of Biological Chemistry,2004,279(45):47066-47075.

[23] NIE Q,FANG M,XIE L,etal.cDNA cloning,characterization,and variation analysis of chicken adipose triglyceride lipase (ATGL) gene[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2009,320(1):67-74.

[24] SHAN T,WANG Y,WU T,etal.Porcine adipose triglyceride lipase complementary deoxyribonucleic acid clone,expression pattern,and regulation by resveratrol[J].Journal of Animal Science,2008,86(8):1781-1788.

[25] 崔歡歡,昝林森,王洪寶,等.牛ATGL基因的cDNA克隆、序列分析及組織表達研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2010,41(2):141-146.

[26] 滕炎玲,羅軍,李君,等.西農(nóng)薩能奶山羊甘油三酯水解酶基因(ATGL)的cDNA克隆與組織表達分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2010,18(6):1134-1142.

[27] AHMADIAN M,ABBOTT M J,TANG T,etal.Desnutrin/ATGL is regulated by AMPK and is required for a brown adipose phenotype[J].Cell Metabolism,2011,13(6):739-748.

[28] CANNON B,NEDERGAARD J.Brown adipose tissue:function and physiological significance[J].Physiological Reviews,2004,84(1):277-359.

[29] MATINEZLOPEZ N,GARCIAMACIA M,SAHU S,etal.Autophagy in the CNS and periphery coordinate lipophagy and lipolysis in the brown adipose tissue and liver[J].Cell Metabolism,2016,23(1):113-127.