產(chǎn)抗菌肽芽孢桿菌的制劑制備及其對仔豬生產(chǎn)性能的影響

曹 丁，黃樂天，李學優(yōu)，黃魁英，張宜靖，夏楓耿

（廣州市微生物研究所，廣東廣州510663）

抗菌肽又稱抗微生物肽，是指廣泛存在于生物體內(nèi)，能抵抗外界病原菌侵害，具有多種免疫活性的先天性防御小分子多肽類物質(zhì)（Nakatsuji等，2012）?？咕姆肿淤|(zhì)量小，水溶性好，熱穩(wěn)定性高，天然無免疫原性，且抗菌譜廣，還具有抗腫瘤病毒和免疫調(diào)節(jié)活性（Ganz，2003）。此外，抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性，可有效解決抗生素濫用導致的耐藥性菌株增加和禽畜產(chǎn)品中出現(xiàn)抗生素殘留等問題（Cao 等，2010）。

多種動物致病菌有良好的殺菌效果，且對陰性致病菌的效果優(yōu)于陽性致病菌。與基因工程類或天然抗菌肽相比，表達穩(wěn)定，且可耐受115℃高溫，對酸堿和蛋白酶耐受性較好，可到達腸道發(fā)揮作用而不失活。

在抗菌肽制劑制備方面，與真空冷凍干燥技術相比，噴霧干燥方法具有干燥能耗較少、生產(chǎn)效率較高、成本低、可連續(xù)進料等優(yōu)點 （付博等，2012），適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，且所得粉末制劑含水量低，可以長期穩(wěn)定保存（Gardiner等，2000）。因此，本研究對有一定熱穩(wěn)定性的產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進行噴霧干燥處理，制成高活性、易于運輸貯存的粉末制劑?？咕膰婌F粉最重要的技術指標是殺菌效價，而制劑水分含量則是決定其儲存期長短的重要因素。本研究運用壓力噴霧干燥機，對經(jīng)微囊化的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進行干燥處理，并對噴霧干燥過程中的主要影響因素如吸附劑（保護劑）的種類、吸附劑的濃度、噴霧的出風溫度和進風溫度進行了優(yōu)化，確定其最佳噴霧干燥工藝條件，以提高產(chǎn)品得率、減少損失，同時獲得性能穩(wěn)定、易于運輸和保存的粉末制劑產(chǎn)品，并對抗菌肽粉末制劑作為飼料添加劑應用于仔豬養(yǎng)殖的效果進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 供試菌 產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌GL08和大腸桿菌K12D31由廣東省微生物種質(zhì)資源庫保存。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母抽提物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH=7.0，固體培養(yǎng)基加20 g/L的瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g/L，蔗糖20 g/L，國產(chǎn)酵母膏30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，氯化鈉1 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，碳酸鈣4 g/L，pH=6.7。效價檢測用培養(yǎng)基：氯化鈉 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，葡萄糖5 g/L，瓊脂粉 20 g/L，pH=7.0。

酵母抽提物，胰蛋白胨：英國 Oxoid公司；瓊脂粉：廣州環(huán)凱生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設備 生化培養(yǎng)箱，DHZ-DA大容量全溫振蕩器，752N型紫外可見分光光度計，50、500、5000 L不銹鋼發(fā)酵罐，壓力噴霧干燥機，顯微鏡，電子天平，pH計等。

1.4 GL08菌株噴霧發(fā)酵液的制備 將斜面保存的GL08菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，然后以1%的接種量接種于50 L發(fā)酵罐中，并經(jīng)過500、5000 L發(fā)酵逐級擴大培養(yǎng)，至穩(wěn)定期后期結束培養(yǎng)，培養(yǎng)過程分別取樣檢測各種生理指標。

1.5 GL08菌株發(fā)酵液的噴霧干燥 將一定比例的保護劑加入待干燥的枯草芽孢桿菌GL08菌株發(fā)酵液中，用攪拌罐充分攪拌混勻，待保護劑溶解完全，可進行噴霧干燥。噴霧過程料液保持低速攪拌，保證粉末質(zhì)量均一。

采用壓力噴霧干燥塔，進風流量保持在40000 m3/h，高壓泵壓力為10～15 MPa。首先設置噴霧干燥器的進風溫度，然后開機預熱，當塔內(nèi)進口溫度達到設定溫度時，開啟高壓泵和噴槍，將料液以一定的流速泵入噴霧塔中，以此來控制出風溫度。干粉儲存于旋風分離器下收集袋中，將干粉收集密封于室溫干燥陰涼處保存。

1.6 噴霧干燥工藝的優(yōu)化

1.6.1 噴霧干燥保護劑的選擇 采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，選擇麥芽糊精、玉米淀粉、輔美粉作為吸附劑和載體進行噴霧干燥處理，控制噴霧的出風溫度為75℃，試驗中各載體添加量均為20%濃度，考察不同載體對抗菌肽噴霧干燥的保護作用。

1.6.2 載體添加量對噴霧干燥的影響 采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，控制噴霧的出風溫度為75℃，用輔美粉作為載體，添加量分別為5%、10%、15%、20%、25%進行發(fā)酵液的噴霧干燥試驗，取樣檢測噴霧粉的殺菌效價和水分含量，比較不同載體添加量對抗菌肽噴霧干燥的影響。

1.6.3 進風溫度對噴霧干燥的影響 采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，控制一定的進料流量，分 別 選 擇 進 風 溫 度 為 130、135、140、145、150、155℃，選用20%的輔美粉載體添加量，進行發(fā)酵液的噴霧干燥試驗，取樣檢測噴霧粉的殺菌效價和水分含量，比較不同進風溫度對抗菌肽噴霧干燥的影響。

1.6.4 出風溫度對噴霧干燥的影響 采用同一批發(fā)酵液作為噴霧料液，調(diào)節(jié)進風溫度為135℃，選用20%的輔美粉載體添加量，分別選擇不同的出風溫度為 60、65、70、75、80、85 ℃， 進行發(fā)酵液的噴霧干燥試驗，取樣檢測噴霧粉的殺菌效價和水分含量，比較不同出風溫度對抗菌肽噴霧干燥的影響。

1.6.5 最佳噴霧工藝參數(shù)的正交試驗 通過單因素試驗考察保護劑種類和添加量、進風溫度、出風溫度對抗菌肽噴霧干燥過程中殺菌效價和水分含量的影響，然后采用三因素三水平正交表試驗設計，以抗菌肽噴霧粉的殺菌效價和水分含量為指標，通過正交試驗確定不同噴霧工藝參數(shù)的最佳組合。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗的因素水平表

1.7 抗菌肽制劑質(zhì)量測定

1.7.1 殺菌效價測定 稱取1 g粉末溶解于9 mL pH 6.0的PBS緩沖液中，離心取上清，采用標準瓊脂孔穴擴散法，參照梁潔等（2009）的方法。

1.7.2 水分含量測定 精確稱量1～3 g抗菌肽粉末制劑，放入鹵素水分測定儀中，記錄測量結果。

1.7.3 抗菌肽得率 計算公式如下：

抗菌肽得率/%=（干燥后每克粉末制劑殺菌效價×制劑總重量）/（干燥前發(fā)酵液每毫升殺菌效價×發(fā)酵液總體積）×100。

1.8 仔豬的生產(chǎn)性能測定 隨機選取60頭30日齡仔豬，大白×大長×杜絡克三元雜交豬，平均重約10 kg，從中挑選20頭體型外貌較差的作為弱仔組，其他40頭隨機分為兩組，分別為對照組和試驗組，其中對照組飼喂基礎日糧，試驗組飼喂含0.01%效價為10萬IU／g抗菌肽制劑的基礎日糧，弱仔組飼喂含0.02%的抗菌肽制劑的基礎日糧，對照組和試驗組隨機分欄，每欄10頭，弱仔組單欄飼養(yǎng)，試驗期30 d，試驗開始前，對豬舍進行徹底清潔消毒，仔豬自由采食飲水，按豬場常規(guī)飼養(yǎng)管理方式進行。每天記錄各組進食量，測定每頭豬的初始體重，結束體重，計算個體平均日增重和平均日采食量，并記錄觀察仔豬在試驗期的健康狀況。

1.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理，并采用T檢驗進行顯著性分析，表中數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 保護劑的篩選 由表2可知，選用不同載體，抗菌肽的得率均在90%以上。選用麥芽糊精作為載體時抗菌肽得率最高，但是其噴霧粉的含水量也偏高，這可能因為麥芽糊精極易吸水。麥芽糊精、水溶淀粉、輔美粉三種物料均可以作為抗菌肽的噴霧載體和吸附劑，但麥芽糊精和玉米淀粉屬于多糖類物質(zhì)，易吸水，水溶液比較黏稠，噴霧粉易貼壁，不易回收，而輔美粉價格較低，在保證產(chǎn)品得率的同時粉末含水量低，故后續(xù)試驗以輔美粉作為噴霧載體。

表2 不同載體對噴霧干燥效果的影響 %

2.2 保護劑添加量對噴霧干燥的影響 保護劑在抗菌肽的噴霧干燥過程中，既可以作為吸附劑載體分散抗菌肽成分，又可以減少抗菌肽的高溫損失。從表3可看出，保護劑濃度越高，抗菌肽得率越高，損失越少，但載體濃度太高時，抗菌肽的效價均偏低，而且高壓泵的壓力會增高，會引起細胞內(nèi)蛋白變性，而降低回收率，也會增加生產(chǎn)工作量和設備負擔?？咕乃趾縿t隨著保護劑濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，水分含量高不利于保存的穩(wěn)定性，根據(jù)噴霧粉質(zhì)量要求，抗菌肽發(fā)酵液選用20%載體添加量最合適。

表3 載體添加量對噴霧干燥效果的影響%

2.3 進風溫度對噴霧干燥的影響 從表4可看出，進風溫度越高，抗菌肽的得率和水分含量越低。當進料流量確定時，進風溫度越高，出風溫度越高，共同影響著抗菌肽的得率和含水量。進料流量提高，出風溫度相應降低，但進料流量過大，會導致噴霧粉含水量增多，粉塵分散性差粒徑增大，極易貼壁，抗菌肽得率和保存穩(wěn)定性降低。綜合考慮，選擇進風溫度為135℃，此時抗菌肽的得率和含水量滿足制劑質(zhì)量要求。

表4 不同進風溫度對噴霧干燥效果的影響

2.4 出風溫度對噴霧干燥的影響 噴霧干燥是將料液霧化成液滴后與熱空氣充分接觸在瞬間蒸發(fā)掉大部分水分。由于干燥時間極短大量水分蒸發(fā)吸熱使得粉粒溫度在極短時間內(nèi)急劇下降，若出風溫度過高說明水分蒸發(fā)后粉粒的溫度仍處于高位，不利于細胞存活。而出風溫度是由進風溫度和進料流量決定的。從表5可看出，出風溫度越高，抗菌肽的得率和含水量越低，當出風溫度高于80℃時抗菌肽的得率明顯降低。出風溫度控制在75℃以下時產(chǎn)品活性損失較少。當出風溫度低于65℃時，噴霧粉的含水量偏高，單位時間內(nèi)的生產(chǎn)量較低，制備的抗菌肽制劑儲存期短，因此選用出風溫度為75℃。

表5 不同出風溫度對噴霧干燥效果的影響

2.5 噴霧干燥最佳工藝確定 從表6可知，出風溫度、進風溫度、保護劑濃度對抗菌肽制劑的效價和含水量影響情況的顯著性排序是相同的，均為出風溫度＞進風溫度＞保護劑含量?？咕牡寐实淖罴呀M合為A1B1C1，含水量的最佳組合為A3B3C2，考慮到出風溫度和進風溫度對抗菌肽得率的影響更顯著，且抗菌肽得率這個指標更重要，因此選擇A2B2水平。保護劑含量對兩個指標的影響不顯著，保護劑濃度過高時，會加重設備負荷和高壓泵壓力，過低時抗菌肽得率降低，因此選擇C2水平。因此，本試驗選擇的最優(yōu)組合為A2B2C2，即出風溫度為75℃，進風溫度為135℃，保護劑濃度為20%，在此水平下，進行3批次的噴霧干燥試驗，抗菌肽得率的平均值為91.6%，含水量為3.94%，達到抗菌肽制劑的質(zhì)量要求。

2.6 抗菌肽制劑對仔豬生產(chǎn)性能的影響 從表7可看出，在試驗期間，添加抗菌肽制劑的試驗組與無添加對照組相比，日增重提高35.2%，料肉比降低25%，弱仔組的日增重雖然沒有明顯提高，但料肉比下降15.3%；試驗組仔豬在試驗期間，無腹瀉發(fā)生，殘次率降低63%，成活率提高8.3%，弱仔組殘次率與對照組相比，降低2%，但腹瀉和死亡情況并無改善。以上數(shù)據(jù)說明抗菌制劑可在飼料中不添加抗生素的前提下，提高斷奶仔豬的成活率，改善豬只腸道健康，降低料肉比和殘次發(fā)生率，減少仔豬腹瀉。

表6 抗菌肽制劑噴霧干燥的正交試驗結果

表7 抗菌肽飼料添加劑對仔豬生產(chǎn)性能的影響

3 結論與討論

本研究利用輔美粉作為保護劑，通過一系列優(yōu)化試驗，運用壓力噴霧干燥塔對產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進行了噴霧干燥最佳工藝的研究，發(fā)現(xiàn)出風溫度對抗菌肽效價有著顯著的影響，出風溫度主要由進風溫度和進料流量決定 （黃樂天等，2014）。當出風溫度高于80℃時，抗菌肽效價明顯降低。最終得到一組最佳噴霧干燥工藝：出風溫度為75℃，進風溫度為135℃，保護劑輔美粉濃度為20%，在此工藝條件下，抗菌肽得率的平均值為91.6%，含水量為3.94%，符合抗菌肽制劑質(zhì)量要求。此工藝生產(chǎn)成本低，效率高，適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

枯草芽孢桿菌已廣泛應用于飼用微生態(tài)制劑的生產(chǎn)中，其在改善畜禽生產(chǎn)性能、維持腸道菌群平衡及提高消化率等方面均有較好的效果（李明華等，2014）。研究表明，單一微生態(tài)制劑存在著作用單一，質(zhì)量不穩(wěn)定，成本高，殺菌效果不如抗生素等缺陷（田木，2015），本研究枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌成分，尤其是抗革蘭氏陰性菌效果顯著。將枯草芽孢桿菌菌體和其代謝產(chǎn)物混合噴霧，在抗菌的同時也起到了調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等作用。將所得的制劑作為飼料添加劑應用于仔豬養(yǎng)殖試驗，可提高仔豬的生長性能，降低腹瀉，提高其健康水平。本研究所得的抗菌肽枯草芽孢桿菌制劑可作為飼料添加劑應用于動物養(yǎng)殖中，更多的動物養(yǎng)殖應用效果試驗有待進一步開展。

[1]付博，馬齊，王衛(wèi)衛(wèi)，等.真空冷凍干燥與噴霧干燥長雙歧桿菌的工藝比較研究[J].食品科學，2012，33（7）：188 ～ 192.

[2]黃樂天，曹丁，黃魁英，等.微囊化蠟樣芽胞桿菌的噴霧干燥工藝優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（20）：6546 ～ 6548.

[3]梁潔，彭中鍵，梁淑娃，等.轉(zhuǎn)基因酵母菌深層發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（6）：639 ～ 640.

[4]李明華，孟秀梅，徐生林，等.枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的制備及其對雛雞生產(chǎn)性能的影響[J].飼料研究，2014，11：1～4.

[5]田木.益生菌復合微生態(tài)制劑的制備工藝及免疫功能研究：[碩士學位論文][D].長春：吉林大學，2015.

[6]Cao D，Li H，Jiang Z，et al.Synthetic innate defence regulator peptide enhances in vivo immunostimulatory effects of CpG-ODN in newborn piglets[J].Vaccine，2010，28（37）：6006 ～ 6013.

[7]Ganz T.Defensins：antimicrobial peptides of innate immunity[J].Nat Rev Immunol，2003，3：710 ～ 720.

[8]Gardiner G E，Sullivan E O，Kelly J，et al.Comparative survival rates of human－derived probiotic Lactobacillus paracasei and L.salivarius strains during heat treatment and spray drying[J].Applied and Environmental Microbiology，2000，6：2605 ～ 2612.

[9]Nakatsuji T，Gallo R L.Antimicrobial peptides：old molecules with new ideas[J].JInvest Dermatol，2012，132（3 Pt 2）：887 ～ 895.