高濃度乙烯利刺激誘導橡膠樹死皮發(fā)生過程中的膠乳生理研究

何 晶，馮成天，郭秀麗，胡義鈺，孫 亮，王真輝，袁 坤*

(1.海南大學 熱帶農林學院，海南 海口 570100；2.中國熱帶農業(yè)科學院 橡膠研究所，農業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

橡膠樹是重要的熱帶經濟作物，由其產生的天然橡膠是一種戰(zhàn)略物資，在國民經濟和國防建設中發(fā)揮著巨大作用。天然橡膠主要是來源于巴西橡膠樹(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)乳管細胞中的膠乳。橡膠樹死皮(Tapping Panel Dryness,TPD，即割面干涸)，是指乳管細胞喪失部分或全部產膠能力的現象，其癥狀為割線排膠減少甚至是完全停止排膠[1]，嚴重影響膠乳產量[2-3]，其發(fā)生的生理與分子機制是我國天然橡膠生產急需解決的重要問題。研究死皮發(fā)生動態(tài)變化過程中膠乳生理參數的變化，對橡膠樹死皮發(fā)生機理的闡明具有一定的指導意義。

乙烯利廣泛應用于天然橡膠割膠生產，具有增產的效果，但隨著乙烯利的過度使用，其副作用也日益體現，主要表現為排膠線內縮、樹皮肥腫和死皮等[4]。有研究認為，橡膠樹死皮發(fā)生后，膠乳黃色體穩(wěn)定性下降，黃色體破裂指數增加[5]，死皮樹中膠乳的硫醇含量明顯下降，其作為自由基清除劑不能有效地清除有毒氧對黃色體膜的危害，所以導致黃色體膜受損，乳管停止排膠而逐漸死皮[6]。Putranto[7]等的研究表明，與正常樹相比，死皮樹膠乳中蔗糖、硫醇和無機磷含量均下降，暗示了死皮樹乳管產膠能力下降。郭秀麗[8]等對橡膠樹不同死皮程度植株的膠乳生理參數進行分析，結果顯示，膠乳產量、硫醇和無機磷含量等隨死皮程度的增加而降低，而蔗糖、鎂離子含量及黃色體破裂指數等隨死皮程度的增加而增加。

現有關于橡膠樹死皮發(fā)生的生理基礎的研究，主要是在膠園中直接選取健康樹和死皮樹進行比較分析，這種研究很難反映死皮發(fā)生的動態(tài)變化過程中生理指標的變化。本研究采用高濃度乙烯利刺激的方法，逐步誘導橡膠樹死皮的發(fā)生：乙烯利刺激過程中，健康樹割線癥狀由排膠線正常，逐漸轉變?yōu)榕拍z線內縮(指割膠后排膠線比正常情況下明顯變窄的現象，簡稱“內縮”)、嚴重內縮(指割膠后在割線上只能看到緊挨割面處有一條很窄的排膠線)[9]，直至割線部分不排膠，即發(fā)生死皮。研究死皮發(fā)生動態(tài)變化過程中植株膠乳各生理參數的變化，從而為闡明橡膠樹死皮發(fā)生機理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于海南省儋州市西慶民營膠園，品系為橡膠樹無性系熱研7-33-97，2006年定植，2015年開割，采用s/2 d/3割制(割線長度為樹圍的1/2，每3 d割1刀)。試驗前，該林段每年施用2次橡膠樹專用復合肥，主要包括有機質、氮、磷、鉀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的選擇與處理 選擇樹圍大小相對一致、樹皮完好、割面排膠正常的健康橡膠樹作為試驗材料。 2016年9-11月，用5%乙烯利濃度[10](一般生產上使用的乙烯利濃度為0.5%～1%，隨著割齡增加，乙烯利濃度會適當增加，但一般不超過3%，而且涂乙烯利的周期一般是2次/月，涂施濃度太大或頻率提高，都會對橡膠樹造成傷害，導致死皮的發(fā)生)刺激所選取的健康樹來誘導死皮的發(fā)生，即每10 d沿割線在割面2 cm寬處均勻涂刷乙烯利1次，共涂刷7次。健康樹作為對照，健康樹經5%乙烯利處理1個半月后產生割線內縮癥狀、2個月后產生嚴重內縮癥狀，2個半月后產生部分不排膠(死皮)癥狀。每種癥狀選取9株樹，分成3組，每組3株樹作為一個生物學重復，即每個處理3個生物學重復。取割膠后5～25 min排出的膠乳，每個生物學重復3株樹各取10 mL膠乳等量混合，置于冰上后迅速帶回實驗室進行膠乳各生理參數的測定。

1.2.2 膠乳生理參數測定 膠乳產量、干膠含量及pH值的測定參照郭秀麗[8]等的方法進行；膠乳硫醇含量參考魏芳[11]等的DTNB試劑法進行測定；無機磷含量的測定采用鉬酸銨比色法進行[12]；蔗糖含量的測定采用蒽銅試劑法進行[13]；粗酶液蛋白質含量及黃色體破裂指數分別參照袁坤[2]等、程成[14]等的方法進行測定。

1.3 數據統(tǒng)計分析

用Excel 2007、SAS 9.0以及Origin Pro 2015軟件進行數據的處理、統(tǒng)計分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中膠乳產量和干膠含量的變化

乙烯利刺激誘導橡膠樹死皮發(fā)生的動態(tài)變化過程中，健康樹割線癥狀由排膠線正常逐漸轉變?yōu)閮瓤s、嚴重內縮，直至部分死皮的發(fā)生。在這一動態(tài)變化過程中，平均單株膠乳產量呈現先上升后下降的趨勢。未涂乙烯利之前，即健康樹(對照)的膠乳產量為97.50 mL，涂高濃度乙烯利后割線出現內縮癥狀時，膠乳產量顯著提高(P<0.05,下同)，達最大值228.20 mL，是對照的2倍多。隨著乙烯利刺激時間的增加，當割線出現嚴重內縮時，膠乳產量顯著下降至86.60 mL。當出現部分死皮時，產量顯著下降至最低值30.20 mL，約為對照健康樹膠乳產量的31%(圖1)。

注：圖柱上方不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

圖1乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中膠乳產量的變化

Fig.1 The change of latex yield during TPD occurrence induced by ethrel stimulation

干膠含量的變化趨勢與膠乳產量的變化趨勢基本一致，也呈先上升后下降的趨勢。健康樹的干膠含量為23.59 %，內縮癥狀時植株干膠含量顯著上升至最大值39.09 %，隨后干膠含量顯著下降，發(fā)生部分死皮植株的干膠含量降至最低值22.11 %(圖2)。

2.2 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中膠乳各生理參數的變化

乙烯利刺激后，膠乳硫醇、無機磷及蔗糖含量均發(fā)生顯著變化，同未刺激前植株相比，差異均達顯著水平，且三者變化趨勢一致，均表現出先上升后下降的趨勢。乙烯利刺激前，膠乳硫醇、無機磷和蔗糖含量最低，分別為0.48、4.11 mmol/L和11.79 mmol/L；刺激后割線出現內縮癥狀時，膠乳硫醇、無機磷和蔗糖含量顯著提高，達到最高值，分別為1.56、 32.76 mmol/L和58.10 mmol/L，約為對照的3倍多、8倍和4倍；隨后膠乳硫醇、無機磷和蔗糖含量又顯著下降，部分死皮時，三者分別為0.66、23.28 mmol/L和25.41 mmol/L。不同癥狀之間膠乳硫醇、無機磷和蔗糖含量均達顯著性差異。

圖2 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中干膠含量的變化

圖3 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中硫醇含量的變化

乙烯利刺激前后膠乳pH值和粗酶液蛋白含量也均呈先上升后下降的趨勢。嚴重內縮癥狀出現之前，健康及內縮植株間膠乳pH值無明顯差異，內縮時膠乳pH值最高，為7.06。隨后pH值下降，部分死皮出現后，膠乳pH值顯著下降至最低值6.49；而粗酶液蛋白含量在植株割線癥狀由正常向嚴重內縮變化的過程中，呈顯著上升趨勢，嚴重內縮時上升至最大值15.85 mg/L，隨后顯著下降，部分死皮出現時降至最低值15.22 mg/L。

值得注意的是，乙烯利刺激后，黃色體破裂指數的變化趨勢與上述各生理指標變化趨勢不同，呈先下降后顯著上升的趨勢。健康植株黃色體破裂指數為18.72%，當割線出現內縮時，黃色體破裂指數顯著下降，達最低值14.27%。隨后又顯著上升，出現嚴重內縮時，破裂指數上升至19.15%，當部分死皮出現后，破裂指數顯著增加到最高值33.69%，約為健康植株的1.8倍。

圖4 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中無機磷含量的變化

圖5 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中蔗糖含量的變化

圖6 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中pH值的變化

3 結論與討論

采用乙烯利刺激已成為提高橡膠樹產量的重要手段，并在天然橡膠生產中大面積推廣應用[15-16]，涂施乙烯利可促使橡膠樹膠乳產量增加1.5～2倍[17]。但是過度的乙烯利刺激會導致橡膠樹死皮的發(fā)生。乙烯利過度刺激誘導橡膠樹死皮的組織學、生物化學等方面前人已開展過一些研究[4,18-20]，但關于生理方面的研究還未見報道。

圖7 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中粗酶液蛋白含量的變化

圖8 乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中黃色體破裂指數的變化

本研究結果表明，高濃度乙烯利刺激后，割線由正常排膠逐漸發(fā)展為排膠線內縮、嚴重內縮，最后部分割線不排膠，即死皮發(fā)生。吳繼林[4]等通過對過度乙烯利刺激后割線樹皮結構變化的研究中發(fā)現，長時間過度刺激采膠導致失去排膠功能的乳管列從樹皮外層逐漸擴展到樹皮內層，直至死皮的發(fā)生，這與本研究的觀測結果一致。

膠乳產量和干膠含量反映了膠乳的合成和再生能力，而黃色體破裂指數則反映了膠乳中黃色體的穩(wěn)定性、完整性。破裂指數愈大，膠乳愈不穩(wěn)定，愈容易凝固堵塞，使膠乳停排[5,14]。本研究結果顯示，高濃度的乙烯利刺激誘導橡膠樹死皮發(fā)生的過程中，膠乳產量和干膠含量均呈現先上升后下降的趨勢。在刺激的早期出現割線內縮癥狀時，膠乳產量和干膠含量均達最大值，而此時黃色體破裂指數最低。表明刺激早期，乙烯利刺激可能通過提高黃色體的穩(wěn)定性來延長排膠時間，進而增加膠乳產量，這與目前認為的乙烯利刺激增產的機制是一致的[15,21]。隨著刺激時間的延長，膠乳產量和干膠含量明顯下降，當出現部分死皮時，二者均降至最低值，而此時黃色體破裂指數達最大值，這說明乙烯利的過度刺激導致黃色體的穩(wěn)定性受到破壞，黃色體破裂后釋放出凝固因子，膠乳原位凝固致使排膠受阻而死皮發(fā)生[21]。吳繼林[4]等的組織學研究結果也顯示，過度刺激后樹皮乳管內的黃色體破裂并與橡膠粒子一起形成絮狀物，這進一步驗證了本研究的結果。上述研究結果說明，黃色體在高濃度乙烯利刺激誘導橡膠樹死皮發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

本研究的結果可以看出，乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中，除黃色體破裂指數外，其余各生理參數的變化趨勢均呈先上升后下降的趨勢。硫醇是乳管細胞中重要的還原劑，具有清除乳管細胞代謝過程中所產生的有毒氧的功能，從而減少有毒氧對乳管細胞的傷害[11,22]。校現周和蔡磊[20]等的研究顯示，高濃度的乙烯利刺激可提高乳管細胞中活性氧的產生速率和含量。據此推測，在本研究中高濃度的乙烯利刺激誘導橡膠樹死皮發(fā)生過程中，活性氧含量可能也是逐漸增加的。在刺激早期出現內縮癥狀時，硫醇含量達最大值，暗示此時硫醇對活性氧的清除能力較強。隨著刺激時間的延長，硫醇含量逐漸降低至出現部分死皮，說明隨著活性氧的大量產生，硫醇對活性氧的清除能力逐漸下降，導致有毒氧的過多積累對乳管細胞造成傷害，進而可能導致死皮的發(fā)生。

無機磷是反映乳管能量代謝的重要指標。膠乳中無機磷含量高，說明乳管能量代謝活躍[23]。本研究結果顯示，乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中，乳管系統(tǒng)代謝能力先增強后逐漸減弱。

蔗糖是橡膠生物合成的原料，其含量是綜合反映乳管蔗糖供給和利用效率的指標[24]。本研究結果顯示，在誘導死皮發(fā)生過程中，蔗糖含量先升高隨后降低，說明乙烯利刺激后的早期剛出現內縮癥狀時，蔗糖含量顯著上升，即用于合成橡膠的前體充足，膠乳的合成和再生能力較強，因此膠乳產量很高。隨著嚴重內縮及部分死皮的出現，蔗糖含量逐漸下降，進而導致膠乳產量的降低。此外，膠乳pH值與膠乳再生相關[25]，而粗酶液蛋白含量與乳管系統(tǒng)合成代謝相關[26]，二者在乙烯利刺激誘導死皮發(fā)生過程中也發(fā)生顯著變化，表明它們與橡膠樹死皮發(fā)生也是緊密相關的。

橡膠樹死皮發(fā)生是一個動態(tài)變化的過程。本研究利用高濃度乙烯利刺激誘導橡膠樹死皮的發(fā)生，動態(tài)監(jiān)測了死皮發(fā)生過程中膠乳各生理指標的變化，為后續(xù)進一步開展死皮發(fā)生動態(tài)變化過程中相關基因或蛋白的表達變化奠定了基礎，也為闡明橡膠樹死皮發(fā)生機理提供一定的理論依據。

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