長鏈非編碼RNA CAF調節(jié)阿霉素誘導的心肌細胞毒性機制的研究

陳 超，張延慧，王明卉，許 勝，劉翠云,李培峰，王 昆

阿霉素(doxorubicin,DOX)是屬蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素。作為化療藥物廣泛用于治療各種腫瘤，臨床上多用于治療乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、白血病等多種惡性腫瘤[1]。然而，限制其臨床應用的主要因素是化學治療中發(fā)揮抗腫瘤作用的同時帶來的心臟毒性，其劑量的增加和積累會導致更為嚴重的且不可逆的各種擴張性心肌病以及充血性心力衰竭。雖然一些研究表明DOX是心肌細胞凋亡的關鍵刺激因素，但迄今為止，未能找到有效治療DOX誘發(fā)的心臟毒性和心力衰竭的方法[2]。因此，研究和了解這一過程所依賴的分子機制是非常重要的，揭示DOX誘導的心肌細胞凋亡機制將為降低心臟毒性和保護心臟功能提供新的途徑。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200 bp且缺乏蛋白質編碼功能的RNA。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在基因組印記、X染色體沉默以及核內(nèi)運輸、轉錄激活、轉錄干擾、染色質修飾等多種重要的調控過程中扮演重要角色[3]。近年來的研究證實lncRNA可能作為治療的潛在靶點在心臟再生和修復中起重要作用[4]。本研究采用lncRNAs基因芯片篩選表達差異明顯的lncRNAs進行實時定量PCR驗證。

線粒體對細胞的生命和死亡起著重要的作用[5]。線粒體的融合和裂變已被確定為DOX誘導心臟細胞損傷的主要因素之一[6]。51 kDa的線粒體動力學蛋白、MIEF1基因在調節(jié)線粒體形態(tài)中起重要作用。據(jù)報道，敲除MIEF1可降低Drp1的結合并增強線粒體融合[7]，另有報道也發(fā)現(xiàn)MIEF1起到增強線粒體融合作用[8]。然而，目前尚不清楚MIEF1是否參與了DOX治療對心肌細胞線粒體動力學的調控。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 C57BL/6J小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK-(魯)-2014-0007]；昆明小鼠乳鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK-(魯)-2014-0007]；鹽酸阿霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；MIEF1抗體(英國Gibico公司)；內(nèi)參β-actin抗體(武漢博士德公司)；二抗山羊抗兔(北京中杉金橋生物技術有限公司)；山羊抗小鼠(北京中杉金橋生物技術有限公司，商品編號：ZF-0312)；RR820A takara SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(日本TaKaRa公司)；DMEM培養(yǎng)基(英國Gibico公司)；胎牛血清(英國Gibico公司)；胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶(日本TaKaRa公司)；TRIzol試劑盒(日本TaKaRa公司)；RNA反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；放射免疫沉淀法裂解液(北京索萊寶公司)；增強化學發(fā)光液(德國Milli-pore公司)，western-抗二抗去除液(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)。

1.2 實時定量PCR檢測 根據(jù)篩選出的差異表達lncRNAs基因，對研究中上調最為明顯的lncRNA，NONMMUT071802，我們命名為心肌細胞凋亡因子(cardiac apoptosis factor，CAF)進行實時定量PCR驗證。分別檢測正常對照組和DOX處理組總RNA中l(wèi)ncRNA CAF含量。具體實驗方法：采用合適方法提取細胞總RNA，將提取好的總RNA從-80℃冰箱取出，對總RNA使用miRcute mi-RNA First-Strandc DNA Synthesis Kit試劑盒合成第一鏈cDNA。然后對已經(jīng)合成的cDNA使用RR820A takara SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行Real-Time PCR System qPCR反應檢測。最后使用ABI7900熒光定量PCR儀進行定量PCR檢測。上述實驗均重復3次。

1.3 載體的構建 使用PCR擴增lncRNA CAF全長，將擴增后的lncRNA CAF全長雙酶切連接至pcDNA3.1(-)載體的EcoRI和XhoI之間，構建過表達pcDNA3.1(-)-CAF；按照RNA干擾序列設計原則結合慢病毒載體質粒pLKO.1-puro結構的特征設計合成shRNA序列，通過分子克隆技術構建lncRNA CAF的RNA干擾慢病毒載體pLKO.1-CAF-shRNA，酶切位點為AgeI和EcoRI。轉化DH5α大腸桿菌后，挑取陽性克隆子進行質粒抽提電泳及測序鑒定。

1.4 實驗分組

1.4.1 動物分組及給藥 參考相關文獻，建立慢性DOX心臟毒性模型[9-10]，具體如下:將12只C57BL/6J小鼠隨機分成2組:實驗組6只，腹腔注射DOX 5 mg/kg，1周1次，連續(xù)注射4周；同時設立等劑量生理鹽水注射對照組6只，同一時間每周注射。4周后行心臟超聲檢測，評估小鼠心功能狀態(tài)；同時處死小鼠，取出左心室心肌標本。取小鼠心肌組織于-80 ℃中保存，用于后續(xù)基于MIEF1的基因和蛋白表達水平的檢測。

1.4.2 細胞分組 根據(jù)實驗，共分為pcDNA3.1(-)空載對照組、pcDNA3.1(-)-CAF組、pLKO.1空載對照組和pLKO.1-CAF-shRNA(CAF-siRNA)組。

1.5 超聲心動觀察 用4%水合氯醛以0.1 mL/10g劑量腹腔注射麻醉，脫毛后將小鼠仰臥位固定于加溫的檢查臺，連接心電圖電極。

1.6 小鼠體重和心室質量稱重 每次注射藥物注射后稱量體重(body weight，BW)，取第一周稱重和第四周稱重分別為初重和終重。處死小鼠后，立即取出心臟，置于冷生理鹽水中洗去血液，濾紙吸干水分，測心室質量(ventricular weight，VW)，并計算VW/BW的比值。

1.7 乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 用75%酒精浸泡1～3 d齡昆明小鼠乳鼠，消毒2次，無菌操作下取出心臟，用預冷的磷酸鹽緩沖液沖洗2遍。于滅菌超凈臺中用眼科剪取心尖大部放入盛有1×ADS buffer的小平皿中，并放在冰臺上清洗3次后剪刀剪碎并用混合酶液(膠原酶：10 mg/mL，胰液素：30 mg/mL)消化，所提取的細胞置于含有5%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，種于6孔板，細胞濃度調到(0.5～1)×105/mL。差速貼壁2 h后更換新的培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.8 細胞轉染 將6孔板中生長狀態(tài)良好的乳鼠心肌細胞用Lipofectamine2000將pcDNA3.1(-)空載、pcDNA3.1(-)-CAF、pLKO.1空載和pLKO.1-CAF-shRNA(CAF-siRNA)轉入細胞中。分別為pcDNA3.1(-)空載對照組、pcDNA3.1(-)-CAF組以及pLKO.1空載對照組和pLKO.1-CAF-shRNA(CAF-siRNA)組。置37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育，24 h后提取細胞產(chǎn)物。

1.9 qRT-PCR檢測MIEF1基因的表達 組織樣本:取100 mg心肌組織樣本加1 mL TRIzol試劑冰上研磨裂解細胞；細胞樣本:細胞轉染24 h后用TRIzol試劑裂解細胞(6孔板每孔加1 mL TRIzol試劑)。細胞裂解后用TaKaRa逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。用ABI StepOne實時PCR系統(tǒng)進行反應擴增。反應條件:95 ℃ 5 min、95 ℃10 s、60 ℃ 30 s共34個循環(huán)，實驗重復3次。以β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.10 蛋白印跡法檢測蛋白表達 組織樣本：每組取3只小鼠心室標本以100 ug/mL TRIzol分別行組織勻漿，組織裂解液裂解，提取上清液，BCA法行總蛋白定量，測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品(40 μg/孔)進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將凝膠轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉 1 h后加入MIEF1的兔 -多克隆抗體(1∶1 000)，室溫孵育2 h后用TBST緩沖液(NaCl 8.5 g/L、Tris 6.05 g/L、Tween20 1 mL/L，pH=7.45)洗膜,HRP-山羊抗兔IgG 的二抗 (1 ∶2 000)孵育1.5 h，增強化學發(fā)光法檢測，X線顯影。掃描并保存圖像后，用western一抗二抗去除液清洗PVDF膜后重新進行封閉，加入β-actin的小鼠多克隆抗體(1：2 000)及HRP-山羊抗小鼠IgG 的二抗 (1 ∶2 000)孵育，顯影后保存影像并以β-actin表達作內(nèi)參分析結果。

細胞樣本：細胞轉染48 h后，用蛋白裂解液裂解細胞提取總蛋白，后續(xù)操作同組織樣本中總蛋白的提取。

2 結果

2.1 小鼠體重與心臟重量的變化 正常對照組BW明顯增加，而實驗組BW明顯降低，2者有顯著差異(P<0.05)，2組VW相比無顯著差異，而實驗組VW/BW明顯增加，和正常對照組比較有顯著差異(n=6;P<0.05，表2)。

表2 注射藥物4周后2組BW、VW及VW/BW

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 小鼠心臟功能檢測 DOX處理組(圖1B)小鼠心臟超聲心動波形圖與對照組(圖1A)相比，振幅降低，頻率略有減少，心室容積下降，其心功能下降明顯。

圖1 小鼠超聲心動圖

2.3 差異表達明顯的lncRNA CAF行RT-PCR驗證 2 μmol/L DOX處理24 h后，DOX組lncRNA CAF的表達水平明顯高于對照組(P<0.01,圖2)。

注：與對照組比較，n=4;*P<0.01圖2 2 μmol/L DOX處理的心肌細胞中 lncRNA CAF的表達量

2.4 DOX對心肌細胞內(nèi)MIEF1的抑制作用

2.4.1 心臟毒性模型中各組MIEF1的表達水平經(jīng)5 mg/kg濃度DOX體外注射4周后，每組取3只小鼠的心室標本做MIEF1實驗的基因表達量檢測。RT-PCR結果顯示DOX誘導的心臟毒性模型組中MIEF1在基因水平上的表達量低于對照組(n=3；t=14.978，因P<0.01，圖3)。每組取4只小鼠的心室標本做MIEF1的蛋白水平表達量檢測。蛋白印跡法檢測結果顯示DOX處理組中基因MIEF1在蛋白質水平上的表達量都低于對照組(n=4;t=8.47，P<0.01，圖4)。

注：與對照組比較，n=3;*P<0.01圖3 DOX心臟毒性模型中MIEF1的基因表達量變化

圖4 DOX心臟毒性模型中MIEF1的蛋白表達量變化

2.4.2 小鼠原代心肌細胞中的各組MIEF1的表達水平 2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L DOX處理24 h后，小鼠原代心肌細胞每組中基因MIEF1在基因水平上的表達量都低于對照組，并且其表達量呈明顯的梯度遞減(n=4；t2 μmol/L=33.423,P<0.01；t4 μmol/L=36.120,P<0.01；t6 μmol/L=40.205,P<0.01，圖5)，蛋白印跡法檢測結果顯示小鼠原代心肌細胞中2 μmol/L DOX處理組中基因MIEF1在蛋白質水平上的表達量都低于對照組(n=4，P<0.05，圖6)。

注：2 μmol/L DOX組與對照組比較，n=4;*P<0.01； 4 μmol/L DOX組與對照組比較，n=4;**P<0.01； 6 μmol/L DOX組與對照組比較，n=4;***P<0.01圖5 不同濃度的DOX對小鼠原代心肌細胞表達量的變化

圖6 2 μmol/L DOX處理的乳鼠心肌細胞中MIEF1 的蛋白表達量變化

2.5 小鼠原代心肌細胞中CAF對MIEF1基因表達水平的影響 pcDNA3.1(-)-CAF過表達組MIEF1的表達水平明顯低于對照組(n=4；t=12.909,P<0.01)；si-lncRNA組細胞的MIEF1表達水平明顯高于NC組(n=4；t=33.634,P<0.01，圖7)。

注：與對照組比較，n=4;*P<0.01；n=4;**P<0.01圖7 乳鼠心肌細胞內(nèi)MIEF1的mRNA水平相對表達

2.6 小鼠原代心肌細胞中CAF對MIEF1蛋白表達水平的影響 2 μmol/L DOX處理24 h后，pcDNA3.1(-)-lncRNA過表達組MIEF1的表達明顯低于NC組(P<0.05)，si-lncRNA組中MIEF1的表達明顯高于對照組(P<0.05，圖8)。

注：與對照組比較，n=4;*P<0.01；n=4;**P<0.01圖8 MIEF1在各組中的表達

3 討論

DOX是一種用于癌癥化療的有效藥物，然而，DOX的使用受到其副作用的極大限制。DOX在許多方面對細胞的存活是惡性的，包括誘導DNA損傷、增加活性氧生成和線粒體過激活[1,11]。心臟似乎是最易感的組織[12]，DOX誘導的心臟毒性通常在臨床實踐中構成挑戰(zhàn)。探索和揭示DOX心臟毒性的潛在機制可能在癌癥治療中具有突破性的發(fā)現(xiàn)，然而，DOX心臟毒性的確切機制仍然在很大程度上是未知的。許多研究表明凋亡在確定心肌細胞的命運方面起重要作用[13]。據(jù)報道，DOX已被證明能激活胱天蛋白酶并誘導心肌細胞凋亡[14-15]。DOX還可以增加氧化劑產(chǎn)生并誘導心肌細胞凋亡，最終導致心肌病[16]。DOX也可能導致心肌細胞中caspase依賴性凋亡[17]。DOX誘導的心臟損傷與心臟氧化應激增加密切相關，抗氧化劑水平降低[18]。

線粒體是不斷進行裂變和融合并在心肌細胞中形成動態(tài)網(wǎng)絡的移動細胞器[19]，線粒體融合產(chǎn)生長線粒體小管，而裂變導致小圓囊泡[20]，線粒體的功能障礙與心臟毒性有關，已被確定為DOX誘導心臟亞細胞損傷的主要靶點之一[6]，線粒體形態(tài)動態(tài)可影響細胞凋亡[21]。因此，保持線粒體完整性對于維持能量產(chǎn)生和防止細胞凋亡至關重要。線粒體不斷經(jīng)歷融合和裂變，這是維持細胞器保真所必需的[22]。線粒體裂隙的抑制增強心肌細胞的功能[23]，線粒體裂變受線粒體裂變蛋白激酶相關蛋白1(Drp1)調控[24]，在線粒體裂變過程中，Drp1聚合并在收縮位點環(huán)化[25]，而抑制Drp1可減輕心肌細胞線粒體裂隙[26]。MIEF1和MIEF2都是線粒體外膜蛋白[27]，研究發(fā)現(xiàn)，敲除MIEF2抑制DOX誘導的線粒體分裂，抑制原代心肌細胞的凋亡以及小鼠的心臟毒性，揭示了由Foxo3a和MIEF2組成的調節(jié)DOX心臟毒性的新途徑[28]。

lnc-RNA在心臟發(fā)育和功能維持中具有重要作用。越來越多的研究表明lnc-RNA在冠心病[29]、先天性心臟病[30]、心肌疾病[31]、心肌肥厚、心肌纖維化以及心力衰竭等方面中發(fā)揮著重要作用。目前為止，lnc-RNA在DOX誘導的心臟毒性上的研究在很大程度上仍然是未知的，值得我們研究。

本研究首次證明lncRNA CAF介導的MIEF1參與DOX心臟毒性的調節(jié)，研究結果將為DOX心臟毒性分子機制的研究提供新的見解。本研究揭示了MIEF1和lncRNA CAF在DOX誘導的心臟毒性中的作用，而lncRNA CAF和MIEF1將是有希望的治療靶點，這一發(fā)現(xiàn)為治療心臟保護提供了治療策略。

【參考文獻】

[1]Octavia Y,Tocchetti CG,Gabrielson KL,et al.Doxorubicin-induced cardiomyopathy:from molecular mechanisms to therapeutic strategies[J].J Mol Cell Cardiol,2012,52(6):1213-1225.

[2]Neilan TG,Blake SL,Ichinose F,et al.Disruption of nitric oxide synthase 3 protects against the cardiac injury,dysfunction,and mortality induced by doxorubicin[J].Circulation,2007,116(5):506-514.

[3]Quinn JJ,Chang HY.Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function[J].Nat Rev Genet,2016,17(1):47-62.[4]Rotini A,Martínez-Sarrà E,Pozzo E,et al.Interactions between microRNAs and long non-coding RNAs in cardiac development and repair[J].Pharmacol Res,2018,127:58-66.

[5]Archer SL.Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases[J].N Engl J Med,2013,369(23):2236-2251.

[6]Suliman HB,Carraway MS,Ali AS,et al.The CO/HO system reverses inhibition of mitochondrial biogenesis and prevents murine doxorubicin cardiomyopathy[J].J Clin Invest,2007,117(12):3730-3741.

[7]Osellame LD,Singh AP,Stroud DA,et al.Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff,MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission[J].J Cell Sci,2016,129(11):2170-2181.

[8]Zhao J,Liu T,Jin S,et al.Human MIEF1 recruits Drp1 to mitochondrial outer membranes and promotes mitochondrial fusion rather than fission[J].EMBO J,2011,30(14):2762-2778.

[9]Fisher PW,Salloum F,Das A,et al.Phosphodiesterase-5 inhibition with sildenafil attenuates cardiomyocyte apoptosis and left ventricular dysfunction in a chronic model of doxorubicin cardiotoxicity[J].Circulation,2005,111(11):1601-1610.

[10]Wang JX,Zhang XJ,Feng C,et al.MicroRNA-532-3p regulates mitochondrial fission through targeting apoptosis repressor with caspase recruitment domain in doxorubicin cardiotoxicity[J].Cell Death Dis,2015,6:e1677.

[11]Zhang T,Zhang Y,Cui M,et al.CaMKII is a RIP3 substrate mediating ischemia-and oxidative stress-induced myocardial necroptosis[J].Nat Med,2016,22(2):175-182.

[12]Buzdar AU,Marcus C,Smith TL,et al.Early and delayed clinical cardiotoxicity of doxorubicin[J].Cancer,1985,55(12):2761-2765.

[13]Adameova A,Goncalvesova E,Szobi A,et al.Necroptotic cell death in failing heart:relevance and proposed mechanisms[J].Heart Fail Rev,2016,21(2):213-221.

[14]Negoro S,Oh H,Tone E,et al.Glycoprotein 130 regulates cardiac myocyte survival in doxorubicin-induced apoptosis through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt phosphorylation and Bcl-xL/caspase-3 interaction[J].Circulation,2001,103(4):555-561.

[15]Khouri MG,Douglas PS,Mackey JR,et al.Cancer therapy-induced cardiac toxicity in early breast cancer:addressing the unresolved issues[J].Circulation,2012,126(23):2749-2763.

[16]Nozaki N,Shishido T,Takeishi Y,et al.Modulation of doxorubicin-induced cardiac dysfunction in toll-like receptor-2-knockout mice[J].Circulation,2004,110(18):2869-2874.[17]Wang S,Konorev EA,Kotamraju S,et al.Doxorubicin in-duces apoptosis in normal and tumor cells via distinctly di-fferent mechanisms intermediacy of H(2)O(2)- and p53-dependent pathways[J].J Biol Chem,2004,279(24):25535-25543.

[18]Kim SY,Kim SJ,Kim BJ,et al.Doxorubicin-induced reactive oxygen species generation and intracellular Ca2+increase are reciprocally modulated in rat cardiomyocytes[J].Exp Mol Med,2006,38(5):535-545.

[19]Chan DC.Mitochondria:dynamic organelles in disease,aging, and development[J].Cell,2006,125(7):1241-1252.

[20]van der Bliek AM,Shen Q,Kawajiri S.Mechanisms of mitochondrial fission and fusion[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5(6):a011072.

[21]Hom J,Sheu SS.Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells[J].J Mol Cell Cardiol,2009,46(6):811-820.

[22]Chen Y,Liu Y,Dorn GW.Mitochondrial fusion is essential for organelle function and cardiac homeostasis[J].Circ Res,2011,109(12):1327-1331.

[23]Givvimani S,Pushpakumar SB,Metreveli N,et al.Role of mitochondrial fission and fusion in cardiomyocyte contractility[J].Int J Cardiol,2015,187:325-333.

[24]Jagasia R,Grote P,Westermann B,et al.DRP-1-mediated mitochondrial fragmentation during EGL-1-induced cell death in C.elegans[J].Nature,2005,433(7027):754-760.

[25]Rosenbloom AB,Lee SH,To M,et al.Optimized two-color super resolution imaging of Drp1 during mitochondrial fission with a slow-switching Dronpa variant[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(36):13093-13098.

[26]Ikeda Y,Shirakabe A,Maejima Y,et al.Endogenous Drp1 mediates mitochondrial autophagy and protects the heart against energy stress[J].Circ Res,2015,116(2):264-278.

[27]Palmer CS,Osellame LD,Laine D,et al.MiD49 and MiD51, new components of the mitochondrial fission machinery[J].EMBO Rep,2011,12(6):565-573.

[28]Zhou L,Li R,Liu C,et al.Foxo3a inhibits mitochondrial fission and protects against doxorubicin induced cardiotoxicity by suppressing MIEF2[J].Free Radic Biol Med,2017,104:360-370.

[29]Bochenek G,H?sler R,El Mokhtari NE,et al.The large non-coding RNA ANRIL, which is associated with atherosclerosis,periodontitis and several forms of cancer,regulates ADIPORI,VAMP3 and C1lORFl0[J].Hum Mol Genet,2013,22(22):4516-4527.

[30]Carrion K,Dyo J,Patel V,et al.The long non-coding HOTAIR is modulated by cyclic stretch and WNT/β-CATENIN in human aortic valve cells and is a novel repressor of calcification genes[J].PLoS One,2014,9(5):e96577.

[31]Colley SM,Leedman PJ.Steroid receptor RNA activator-a nuclear receptor coregulator with multiple partners:insights and challenges [J].Bioehimie,2011,93(11):1966-1972.