基于紅外光譜指紋和揮發(fā)性組分信息融合模型鑒別大米產(chǎn)地來源

杜夢佳，毛 波，沈 飛，李 彭，裴 斐，胡秋輝，方 勇,*

水稻是世界上主要的糧食作物之一，大米品質容易受到原料品種和產(chǎn)地環(huán)境如土壤、水等因素影響[1]。目前市場上一些不法商家受利益驅使，用一些低檔、劣質稻米冒充地理標志大米，以假亂真，嚴重侵犯了消費者利益，甚至危及生命安全[2-3]。目前常用的大米產(chǎn)地鑒別技術主要有傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）技術、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術等。FTIR技術可反映含氫基團振動引起的倍頻和合頻吸收峰信息[4-5]。當生長環(huán)境變化時，大米中成分組成或結構可能發(fā)生改變，導致不同基團或同一基團在不同環(huán)境中產(chǎn)生的近紅外光譜在吸收峰的位置和強度上有所不同，利用這種差異可以反映大米產(chǎn)品的地域特征[6-8]。Lin等[9]采集了3 種不同品種超級水稻的光譜指紋信息，結合偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）建立了產(chǎn)地鑒別模型，總體鑒別率可達90%。GC-MS是一種用于檢測揮發(fā)組分的有效方法，由于產(chǎn)地環(huán)境對大米中有機揮發(fā)性組分的積累有較大影響，使得利用GC-MS技術進行產(chǎn)地鑒別成為可能[10-12]。Lim等[13]利用GC-MS采集朝鮮和中國大米樣品的揮發(fā)性組分指紋信息，結合PLS-DA建立了產(chǎn)地鑒別模型，具有一定的鑒別效果。還有研究者采用固相微萃取-質譜技術研究不同程度香氣大米樣品的揮發(fā)性組分指紋信息，并結合類比獨立分類法（soft independent modeling of class analogies，SIMCA）進行了分類[14]。

上述大米產(chǎn)地判別方法多是基于單一鑒別指標如光譜指紋信息或揮發(fā)性組分指紋信息，尤其是由于大米中的揮發(fā)性組分指紋信息的不穩(wěn)定性，導致單一指標鑒別結果的準確性和可靠性較差。隨著食品鑒別檢測技術的逐漸成熟，目前，國內(nèi)學者應用信息融合技術檢測食品品質的研究已有較多報道。Sun Wenjuan等[15]采用近紅外光譜融合中紅外光譜建立鑒別正品和贗品大黃的模型，結合SIMCA，支持向量機、人工神經(jīng)網(wǎng)絡、PLS-DA等分析顯著提高了鑒別準確率。陶思嘉等[16]通過融合不同品種葡萄酒的近紅外和中紅外光譜指紋信息，結合貝葉斯和PLS-DA分析，融合信息后的鑒別準確率優(yōu)于單獨采用一種光譜技術的鑒別結果。雖有研究將不同指紋信息融合起來進行鑒別，但這些指標為同種屬性的指紋信息，同樣難以保證鑒別結果的客觀性和準確性。而且根據(jù)查閱文獻可知，融合不同屬性指紋信息進行大米產(chǎn)地鑒別的方法鮮見報道。

因此，為建立一種紅外光譜指紋信息和揮發(fā)性組分信息融合鑒別模型，提高模型對大米產(chǎn)地的鑒別率。本研究以盤錦、射陽和五常大米3 種典型地理標志大米為鑒別對象，篩選3 個產(chǎn)地大米樣品中具有顯著性差異的揮發(fā)性組分和光譜吸光度為特征鑒別指標，利用PLS-DA建立融合信息模型，并且與單一指標模型的鑒別效果進行比較，以期為全面客觀、準確可靠鑒別地理標志大米提供技術理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地理標志大米樣品分別采自中國的江蘇省射陽縣、黑龍江省五常市和遼寧省盤錦市，其中采自江蘇省射陽縣的大米共19 個樣品，分別采自海河鎮(zhèn)、臨海鎮(zhèn)、合興鄉(xiāng)、射陽縣、淮海農(nóng)場、耦耕鎮(zhèn)；采自黑龍江省五常市的大米樣品共15 個樣品，分別采自五常市、安家鎮(zhèn)、民樂鄉(xiāng)、民意鄉(xiāng)、二河鄉(xiāng)、志廣鄉(xiāng)、常卜鄉(xiāng)；采自遼寧省盤錦市的大米樣品共20 個樣品，采自大洼縣；大米樣品均采自2015年秋季的當?shù)剞r(nóng)田，每個采樣點采集2 kg樣品，采用二分法選擇500 g作為分析試樣。

2,4,6-三甲基吡啶、甲醇（均為優(yōu)級純） 阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C型GC-MS聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；手動固相微萃取裝置（50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷纖維頭） 美國Supelco公司；CH-9230型恒溫水浴鍋 瑞士步琪公司；TP-214型電子分析天平北京丹佛儀器有限公司；Tensor27型傅里葉紅外光譜分析儀 德國Bruker公司；101-3AS型電熱鼓風干燥箱上海蘇進儀器設備廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

分析試樣處理按照GB/T 1354—2009《大米》粳米一級加工標準進行加工。

大米粉碎處理：用研磨粉碎機分別對精米樣品磨粉30 s，為了獲得均勻顆粒，粉碎的樣品均通過80 目篩子篩選，粉碎好的樣品分裝在潔凈的樣品袋中，密封，置于溫度20 ℃，含水量為14%的干燥器中，備用。

1.3.2 FTIR光譜采集[17]

利用Tensor 27型FTIR和45 ℃ ZnSe衰減全反射附件掃描大米樣品的光譜指紋信息。采用固體壓片法取約0.50 g樣品置于直徑為13 mm的ZnSe晶體上，鋪布均勻，加壓至0.8 GPa，保持1 min，光譜區(qū)域設定為0～4 500 cm－1，分辨率為8 cm－1，掃描次數(shù)為32 次，以空氣為背景，室溫條件下測定，采集紅外光譜，取每個產(chǎn)地大米樣品的平均光譜作為該產(chǎn)地的最終紅外譜圖，每做完一個樣品采用酒精棉球擦拭樣品槽。

1.3.3 GC-MS檢測[18]

稱取6.00 g大米顆粒（距樣品封存1 周）置于頂空樣品瓶中，加入1 μL內(nèi)標物質（1 μL 2,4,6-三甲基吡啶用甲醇定容在5 mL的容量瓶），密封后置于預先設好的恒溫（80 ℃）水浴鍋中平衡50 min，再將萃取頭插入頂空瓶吸附60 min，于GC-MS進樣口解吸5 min。每個樣品進行3 次重復。

GC-MS檢測參數(shù)：HP-5MS毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：從柱初溫50 ℃升至125 ℃，速率為8 ℃/min，保持3 min，然后升至165 ℃，速率為4 ℃/min，保持3 min，最后升至230 ℃，速率為10 ℃/min，保持2 min，后運行為2 min。第1次使用萃取針時，萃取頭需要在GC進樣口（氮氣保護條件下）老化2 h，老化溫度為270 ℃。在以后的使用過程中，使用前需要在以上溫度條件下老化20 min，脫去萃取頭上的雜質。載氣N2；載氣流速1.0 mL/min；AUX-2溫度280 ℃；電子電離源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；采集模式全掃描。

1.3.4 信息融合[19]

將已獲得的共54 份大米樣品的特征光譜范圍吸光度和特征揮發(fā)性組分含量作為自變量，產(chǎn)地分類作為因變量，其中提取的每個樣品的特征光譜范圍中每個波數(shù)點對應的吸光度為一個變量，即將數(shù)據(jù)列為n×p數(shù)據(jù)矩陣X和n×q數(shù)據(jù)矩陣Y，n為樣本數(shù)，p為自變量，q為分類變量，取2/3的樣品作為建模集，1/3的樣品作為驗證集，建模集用于構建指紋因子-大米產(chǎn)地模型，驗證集用于對構建的模型進行驗證、評價，利用Matlab 8.0軟件對建模樣本的自變量矩陣X和分類變量Y建立模型，判斷樣品所屬類別。

為了評價上述基于融合信息建立的PLS-DA模型的適用性與合理性，采用相同方法獲得了基于單一指紋信息建立的鑒別模型，即大米產(chǎn)地與大米揮發(fā)性組分因子、大米產(chǎn)地與大米光譜指紋因子模型，對這3 種模型進行對比分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS 16.0進行ANOVA分析，Matlab 8.0軟件進行PLS-DA分析。PLS-DA是一種基于PLSR的多變量統(tǒng)計分析方法，它是對原始矩陣（揮發(fā)性組分指紋信息或光譜指紋信息）X和類別變量Y之間的關系進行計算，得到X與Y的最大協(xié)方差，通常設定模糊變量的臨界值（±0.5）來判定樣品的分類歸屬，利用留一交叉驗證法獲得PLS-DA模型的最優(yōu)潛變量數(shù)（LV），評估模型的鑒別精密度[20]。GC-MS實驗數(shù)據(jù)由計算機檢索并與圖譜庫（NIST 08）的標準質譜圖對照進行分析，再結合相關文獻進行人工譜圖解析，根據(jù)大米樣品的GC-MS指紋圖譜、離子峰的保留時間和峰面積找到共有峰，確認大米樣品中揮發(fā)性組分的化學結構和名稱，其相對含量采用峰面積歸一化法分析。

2 結果與分析

2.1 特征光譜指紋信息的提取

圖1 盤錦、射陽和五常大米樣品的FTIR平均光譜圖Fig. 1 FTIR average spectra of rice samples from Panjin,Sheyang and Wuchang

如圖1a所示，3 種大米的光譜圖整體趨勢一致，表明它們的化學成分比較相似。而在特定波數(shù)范圍內(nèi)（960～1 060、1 601～1 685 cm－1和3 000～3 620 cm－1），3 種大米的光譜信息存在差異，如圖1b～d所示，在這3 組波數(shù)范圍內(nèi)，射陽大米光譜吸光度均明顯高于盤錦和五常大米，這與其生長環(huán)境如土壤、水源等密切相關，有可能是射陽獨特的環(huán)境氣候，水稻生長早期積溫偏低，使得營養(yǎng)生長期相對較長，在作物成熟期，積溫較高，光照充足等原因，更利于干物質積累和沉淀，加上射陽土壤富鉀的特性，更利于大米中多糖的形成[21-23]。其中在960～1 060 cm－1范圍內(nèi)的光譜峰為多糖的特征吸收區(qū)，在994 cm－1附近的強吸收峰與多糖的C—O的伸縮振動相關[24-25]。在1 601～1 685 cm－1光譜范圍內(nèi)的吸收峰為酰胺化合物的特征吸收區(qū)，在1 643 cm－1附近的吸收峰與—CONH中C—O伸縮振動及有機羧酸鹽COO—的不對稱振動相關[24,26]。3 000～3 620 cm－1范圍為亞甲基（—CH2）、甲基（—CH3）、羥基（—OH）和氨基（—NH）的振動吸收峰，在3 286 cm－1附近強而寬的吸收峰，是核苷酸、氨基酸的N—H伸縮振動和羥基O—H伸縮振動的疊加，這部分的吸收主要反映出大米中核酸、蛋白質、脂肪酸和碳水化合物（纖維素、多糖）等對光譜的貢獻[27]。因此，選取光譜范圍在960～1 060、1 601～1 685 cm－1和3 000～3 620 cm－1之間的光譜指紋信息做進一步的產(chǎn)地鑒別。

2.2 特征揮發(fā)性組分指紋信息的提取

表1 盤錦、射陽和五常大米樣品中共有揮發(fā)性組分的GC-MS結果Table 1 GC-MS analysis of common volatile compounds in rice samples from Panjin, Sheyang and Wuchang

利用GC-MS對20 份盤錦、19 份射陽和15 份五常大米中的揮發(fā)性組分進行分析檢測，這3 種大米中分別檢測出127、137 種和119 種化合物。在此基礎上，找到在相同保留時間條件下，3 個產(chǎn)地的大米樣品中共同存在的揮發(fā)性組分，通過篩選，獲得共有揮發(fā)性組分13 種，如表1所示。盤錦大米中反-2-壬烯醛、壬醇、萘、（＋）-長葉烯和十六烷的相對含量最高。射陽大米中的2-戊基呋喃、壬醛、反-2-壬烯醛、萘、癸醛和十四烷的相對含量最低。在五常大米中，2-戊基呋喃、壬醛和十二烷的相對含量最高，（＋）-長葉烯和十五烷的相對含量最低。此外，在13 種共有揮發(fā)性組分中，苯甲醛、2-戊基呋喃、壬醛、反-2-壬烯醛、壬醇、萘、癸醛、十四烷、（＋）-長葉烯和十五烷這10 種化合物的相對含量因產(chǎn)地不同而具有顯著性差異（P＜0.05）。因此選取這10 種物質作為特征揮發(fā)性組分指紋信息建立鑒別模型。

2.3 PLS-DA信息融合

圖2 基于大米樣品特征揮發(fā)性組分模型（A）、特征光譜模型（B）和融合信息模型（C）PLS-DA的得分圖Fig. 2 PLS-DA score plots of characteristic volatile model (A),characteristic spectral model (B), and information fusion model (C) for rice samples

表2 利用PLS-DA建立3 種鑒別模型的分析結果Table 2 Analysis of three discriminant models established by PLS-DA%

FTIR反映的是化學有機組分中官能團的種類與含量，GC-MS具有定量檢測揮發(fā)性組分的特征，但是大米樣品中的有機化學組分很大程度上受到其生長環(huán)境的影響，僅基于該單一指標鑒別不具有全面性和客觀性，而揮發(fā)性組分的不穩(wěn)定性，在單一指標鑒別中準確率較低，且可靠性較差，因此，紅外光譜和揮發(fā)性組分信息融合是多源信息融合，不同維度數(shù)據(jù)提供的信息具有更強的多樣性[28-29]。基于不同鑒別因子指紋信息建立的PLS-DA模型的前2 個因子得分如圖2所示，由圖2A、B可知，不同產(chǎn)地大米樣品的分布具有顯著性重疊，其中在圖2A中，盤錦大米、射陽大米和五常大米的分布均有交互重疊，在圖2B中，盤錦大米、射陽大米與五常大米的分布具有明顯的重疊，而盤錦大米與射陽大米的分布基本沒有重疊。在圖2C中，3 個產(chǎn)地的大米樣品的分布區(qū)分較為明顯，相互之間基本沒有重疊。此外，從圖2A到圖2C可以看出，不同產(chǎn)地樣品分布重疊的顯著性依次降低，表明基于信息融合建立的PLS-DA模型鑒別大米產(chǎn)地具有一定的可行性。

提取的特征光譜吸光度（范圍為960～1 060、1 601～1 685 cm－1和3 000～3 620 cm－1）和10 種特征揮發(fā)性組分含量（苯甲醛、2-戊基呋喃、壬醛、反-2-壬烯醛、壬醇、萘、癸醛、十四烷、（＋）-長葉烯和十五烷）作為自變量，3 個產(chǎn)地分類作為因變量，導入Matlab統(tǒng)計分析軟件，結合PLS-DA法建立融合信息-大米產(chǎn)地的鑒別模型，并與單一指紋信息建立模型的鑒別效果進行比較分析，如表2所示，驗證集的靈敏性由91.4%（紅外光譜模型）和84.8%（揮發(fā)性組分模型）變?yōu)槿诤虾蟮?7.4%，特異性由92.1%（紅外光譜模型）和82.4%（揮發(fā)性組分模型）變?yōu)槿诤虾蟮?7.0%，表明信息融合模型的鑒別靈敏度和精確度相比于單一指標模型（紅外光譜模型和揮發(fā)性組分模型）有所提高。在單一指紋信息鑒別模型中，揮發(fā)性組分模型的靈敏性為84.8%，表明15.2%的樣品被判為其他類，但其特異性僅為82.4%，說明鑒別精確度不足，這有可能與樣品經(jīng)過脫殼等處理，其揮發(fā)性組分信息受到嚴重干擾，導致樣品誤判率較高[14]。在這3 種鑒別模型中，揮發(fā)性組分模型、紅外光譜模型和信息融合模型的驗證集準確率分別為88.9%、92.9%和97.4%。相比于揮發(fā)性組分模型和紅外光譜模型，信息融合模型的準確率分別提高了8.5%和4.5%，這是因為融合的光譜指紋信息和揮發(fā)性組分指紋信息反映了可能的相互作用和協(xié)同效應[30]。因此，信息融合技術較大的提高了模型的鑒別效果。

3 結 論

大米樣品的紅外光譜主要體現(xiàn)的是有機組分中分子基頻振動的信息，GC-MS體現(xiàn)的是揮發(fā)性組分信息，二者信息來源不同且屬性不同，PLS-DA信息融合充分利用了這2 種信息，實現(xiàn)了信息互補。本方法可以通過修正部分單獨鑒別時混淆或者錯判的樣品，得出正確結果，從而提高鑒別準確率和可信度，使得信息融合處理后模型的鑒別準確率提高。

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