BMP-2對間充質(zhì)干細(xì)胞促進造血干細(xì)胞增殖的影響及其機制

李書壇，黃遠(yuǎn)瓊，汪姝玥，林凡莉，黃純蘭,3

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川滬州646000；2瀘州市中醫(yī)醫(yī)院；3成都市第三人民醫(yī)院)

骨髓中的造血干細(xì)胞(HSC)具有自我更新和分化為各種成熟血細(xì)胞的能力，但其數(shù)量少。隨著干細(xì)胞移植(HSCT)技術(shù)的飛速發(fā)展，對HSC的需求增加，使得體外擴增HSC成為當(dāng)前研究的熱點。HSC增殖、分化和歸巢受骨髓微環(huán)境即微龕“Niche”的調(diào)控。Niche由基質(zhì)細(xì)胞、其前體間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)以及它們表達(dá)和分泌的黏附分子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)組成，包括以成骨細(xì)胞為主體的骨內(nèi)膜龕和以內(nèi)皮細(xì)胞為主體的血管微龕。研究顯示，MSC可促進HSC增殖[1～3]，但作用機制復(fù)雜、尚未闡明。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)/TGF-β家族在造血調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，該家族成員形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控HSC增殖[4,5]。BMP-2是該家族中的一員，作為一種多功能蛋白，其能促進新骨及血管的形成。近年來研究顯示，BMP-2協(xié)同MSC可以促進血管生成[6]。2014年7月～2016年3月我們進行本研究，旨在從成血管角度探討B(tài)MP-2協(xié)同MSC對HSC增殖的影響及可能的機制。

1　材料與方法

1.1材料LG-DMEM培養(yǎng)基、FBS、青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司，美國)，鼠抗人ECD-CD34、鼠抗人PEcy7-CD45、鼠抗人FITC-CD105、鼠抗人IgG抗體(Pharmingen公司，美國)，重組人干細(xì)胞因子(rhSCF)、重組人白介素3(rhIL-3)、rhBMP-2(RD公司，美國)；Mini MACS免疫磁性吸附柱分離裝置和CD34+細(xì)胞選擇試劑盒(Mitenyi Biotec公司，德國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司，日本)，熒光PCR試劑盒(QIAGEN公司，德國)，TRIzol試劑盒(Invitrogen 公司，美國)，Transwell小室(微網(wǎng)孔徑0.4 μm，Costar公司，美國)。β-actin、Ki67、血管生成素受體2(Tie2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素1(Ang1)引物，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。骨髓來自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院健康志愿者，其中男9例、女4例，年齡21～47(32.72±2.01)歲。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，健康志愿者知情同意并簽字。

1.2MSC擴增和鑒定取健康志愿者髂骨骨髓，肝素抗凝管收集，按1∶4體積與完全培養(yǎng)基重置(完全培養(yǎng)基成分為89% LD-DMEM +10% FBS+1%青/鏈霉素)，混合后接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。每3天換液一次，待細(xì)胞融合達(dá)80%后用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳至第3代備用。倒置相差顯微鏡觀察MSC形態(tài)及貼壁、融合等生長情況。顯微鏡下顯示，全骨髓法原代培養(yǎng)MSC 72 h可見散在的梭形貼壁細(xì)胞；第14天時梭形細(xì)胞融合度可達(dá)80%，排列成放射狀、旋渦狀；第3代MSC在培養(yǎng)6天時融合度可達(dá)80%。原代培養(yǎng)細(xì)胞生長周期偏長，傳代細(xì)胞增殖較快且背景干凈。采用流式細(xì)胞儀檢測第3代MSC表面抗原CD34、CD45、CD105表達(dá)。結(jié)果顯示， CD34、CD45、CD105陽性表達(dá)率分別為2.2%、0.3%、52.4%。提示MSC分離培養(yǎng)成功。流式細(xì)胞儀檢測MSC的純度為52.4%。

1.3HSC分選及純度鑒定取健康志愿者髂骨骨髓，經(jīng)預(yù)冷的PBS稀釋后輕緩地加入Ficoll分離液上層，4 ℃下2 000 r/min離心20 min，收集白色細(xì)胞層，分選出單個核細(xì)胞，采用Mini MACS免疫磁性吸附柱分離裝置，用CD34+細(xì)胞(即HSC)選擇試劑盒進行CD34+細(xì)胞分離，并用抗CD34-ECD抗體檢測分選細(xì)胞的純度。臺盼藍(lán)染色顯示HSC呈大小均勻的圓形，活性大于95%；流式細(xì)胞儀檢測顯示，HSC純度為81.9%。

1.4MSC對HSC增殖的影響將細(xì)胞分組，HSC組為HSC單獨培養(yǎng)，HSC+MSC組為HSC、MSC共培養(yǎng)；每組3個復(fù)孔。將融合達(dá)80%的第3代MSC接種于Transwell下室，CD34+HSC細(xì)胞接種于上室，前者接種細(xì)胞量為3.20×105個/孔，后者接種細(xì)胞量為1.25×104個/孔，培養(yǎng)基為含10% FBS、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的IMDM完全培養(yǎng)基，每2天每孔添加rhSCF 50 ng/mL、rhIL-3 20 ng/mL，并換液。分別于培養(yǎng)第3、7、10天收集HSC并用計數(shù)板計數(shù)，確定HSC增殖最快的時間點。結(jié)果顯示，HSC增殖最快的時間點為共培養(yǎng)第7天。

1.5BMP-2對MSC促HSC增殖的影響將細(xì)胞分為六組，分別為HSC組、MSC組、HSC+BMP-2組、MSC+BMP-2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP-2組。HSC組、 MSC組單細(xì)胞培養(yǎng)，MSC+BMP-2組、HSC+MSC組分別加入100 ng/mL BMP-2培養(yǎng)，HSC+MSC組兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，HSC+MSC+BMP-2組兩種細(xì)胞與100 ng/mL BMP-2共培養(yǎng)；細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)條件同1.4。于培養(yǎng)第3、5天時更換培養(yǎng)基并添加細(xì)胞因子rhBMP-2，培養(yǎng)第7天時行以下指標(biāo)檢測。

1.5.1HSC計數(shù)采用加樣槍分別吸取10 μL各組細(xì)胞懸液放入細(xì)胞計數(shù)板。顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和下方。計算公式：細(xì)胞數(shù)/mL=四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)/4×104。

1.5.2增殖因子Ki67及促血管形成相關(guān)因子Tie2、VEGF、Ang1 mRNA表達(dá)采用實時熒光定量PCR法檢測。收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取RNA，用分光光度計檢測RNA濃度、A260/A280。將RNA稀釋，采用模板量取1 ng，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為擴增模板，采用熒光定量qRT-PCR法檢測各組CD34+細(xì)胞的Ki67、Tie2、VEGF、Ang1 mRNA。每組接種3個復(fù)孔，計算Ct值。采用2-ΔΔCt法計算上述因子mRNA相對表達(dá)量。Ki67、Tie2、VEGF、Ang1基因及內(nèi)參基因β-actin的引物序列見表1。

表1　Ki67、Tie2、VEGF、Ang1及β-actin的引物序列

2　結(jié)果

2.1各組HSC數(shù)量比較HSC組、HSC+BMP-2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP-2組HSC數(shù)量分別為(15.37±0.42)、(37.81±1.07)、(117.00±2.53)、(129.06±5.13)×104個，組間比較P<0.05或<0.01。

2.2各組Ki67及Tie2、VEGF、Ang1 mRNA表達(dá)比較HSC組、HSC+BMP-2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP-2組Ki67及Tie2 mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，MSC組、MSC+BMP-2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP-2組VEGF、Ang1 mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，組間比較P<0.05或<0.01。見表2。

表2　　　　各組Ki67及Tie2、VEGF、Ang1 mRNA相對表達(dá)量比較

注：“-”表示本組細(xì)胞未進行對應(yīng)基因mRNA檢測。

3　討論

CD34是HSC表面重要的抗原，在臨床及科研工作中常用該抗原分選HSC。目前MSC的培養(yǎng)方法主要包括全骨髓黏附培養(yǎng)法、密度梯度離心法、免疫表型分選法等，全骨髓法因其經(jīng)濟適用、所培養(yǎng)的細(xì)胞活性高，通過傳代可達(dá)到擴增純化的目的，是目前培養(yǎng)MSC的重要方法。本研究應(yīng)用免疫磁珠法及全骨髓法獲得的HSC和MSC的純度分別為81.9%、52.4%，純度較高，能保證后續(xù)實驗研究的進行。HSC作為機體重要的干細(xì)胞，研究其增殖、凋亡等生理活動有利于探索造血以及腫瘤等疾病的發(fā)生機制。隨著干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展，HSC已成為治療血液系統(tǒng)惡性疾病、一些遺傳性和免疫性疾病以及部分惡性實體腫瘤的有效途徑之一。然而HSC數(shù)量少，體外擴增HSC勢在必行。研究發(fā)現(xiàn)，如前所述MSC可促進HSC增殖，這種擴增效應(yīng)依賴于細(xì)胞間的相互作用和分泌的細(xì)胞因子[7,8]，de Silva等[8]將HSC與MSC分別進行非接觸共培養(yǎng)、接觸共培養(yǎng)、單獨培養(yǎng)，結(jié)果顯示在接觸與非接觸兩種情況下MSC均可以促進HSC增殖，且MSC與HSC接觸培養(yǎng)對HSC的增殖促進作用最強。本研究應(yīng)用Transwell將MSC與HSC進行非接觸共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC可以非接觸促進HSC增殖。

研究發(fā)現(xiàn)，MSC能分泌干細(xì)胞因子(SCF)、IL、集落刺激因子(GSF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑3(TIMP-3)等多種細(xì)胞因子、黏附分子，它們形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)可促進HSC增殖[7,9]。目前研究顯示，這些信號通路主要包括CXCLl2/CXCR4、Notch、Wnt、Tie2/Angl、BMP/TGF-β、Hedgehog[2,9,10]。其中，BMP/TGF-β家族調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生理活動。該家族包括TGF-β和BMP兩個亞家族，前者由TGF-β、Activin和Nodal等組成，后者由BMP、GDF和AMH 組成。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的20多種BMP蛋白分布于多種組織，目前研究較多的主要為BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-10等，其受體BMPR包括BMPR-IA，BMPR-IB和BMPR-Ⅱ，它們屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族。BMP-2可以與HSC的BMPRI結(jié)合并促進其下游轉(zhuǎn)錄子Smad-1、Smad-4、Smad-5表達(dá)進而調(diào)控HSC[11]。BMP蛋白是多功能蛋白，大多能促進骨重建及生長，是胚胎和器官發(fā)育的重要因子，在胚胎期能調(diào)控造血[3,12,13]，其在成體中的造血調(diào)控作用目前研究較少。BMP對造血的調(diào)控機制復(fù)雜，不同的BMP具有不同的作用，如BMP-4抑制HSC向紅系分化，BMP-6抑制人B淋巴細(xì)胞形成，即使是同種BMP對HSC的同種生理功能也可能不同[14]。目前研究認(rèn)為這可能與靶細(xì)胞的分化程度[12]、細(xì)胞因子亞型及濃度、甚至生長因子來源于旁分泌還是自分泌等有關(guān)[15]。BMP-2對HSC增殖的影響與培養(yǎng)模式、BMP-2濃度以及所聯(lián)合的細(xì)胞因子種類等具體環(huán)境相關(guān)。Bhatia等[16]發(fā)現(xiàn)，BMP-2可引起NOD/SCID小鼠HSC數(shù)目、集落形成、細(xì)胞表型和多系分化能力的改變，且影響程度與劑量有關(guān)；高濃度(50 ng/mL)BMP-2會抑制細(xì)胞增殖，低濃度(5 ng/mL)BMP-2則對HSC增殖影響較小。將BMP-2與不同的細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)HSC，發(fā)現(xiàn)SCF聯(lián)合GM-CSF能促進HSC增殖[17]，而BMP-2與EPO和IL-3[17]、SCF和SF3[18]、SCF和SF3以及TPO[19]聯(lián)合則無協(xié)同促進作用。 本研究結(jié)果顯示，濃度為100 ng/mL的BMP-2聯(lián)合IL-3、SCF可促進成人HSC增殖，且BMP-2協(xié)同MSC亦能促進HSC增殖。然而，BMP-2對造血的哪個階段進行調(diào)節(jié)，HSC增殖的具體機制以及增殖后的HSC是否分化目前尚不清楚，有待進一步研究。

增殖指數(shù)Ki67基因與細(xì)胞增殖相關(guān)，能反映細(xì)胞增殖的活躍程度，其核蛋白在細(xì)胞G1、S、G2和M期均有表達(dá)，G0期則不表達(dá)。Ki67陽性率越高，說明細(xì)胞增殖越活躍。血管生成受多種信號通路的調(diào)節(jié)，其中最重要的是VEGF/血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)通路。VEGF包括VEGF-A、-B、-C、-D、-E和胎盤生長因子，其中VEGF-A和VEGF-B與血管生成相關(guān)[20,21]。VEGF具有高度特異性，通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖促進血管生成[21]。VEGFR屬于酪氨酸激酶受體超家族(RTK)，由跨膜區(qū)、七個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)和酪氨酸激酶胞內(nèi)區(qū)三部分組成[22]，與血管形成相關(guān)的主要有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，在內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。Ang/Tie2通路在血管形成中發(fā)揮重要作用。Ang主要包括Ang1和Ang2，它們共同的受體為Tie2。Ang1在正常組織中表達(dá)廣泛，參與血管新生及血管成熟[23]。Ang1啟動Tie2受體后使內(nèi)皮周圍平滑肌細(xì)胞和血管周細(xì)胞募集至血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍，通過增加內(nèi)皮細(xì)胞與周圍支持細(xì)胞之間的相互作用，維持血管的完整性與穩(wěn)定性，并降低其通透性。Ang2是Ang1的天然拮抗劑，主要分布于子宮、卵巢和胎盤等部位。Tie2是RTK家族成員，在內(nèi)皮細(xì)胞及某些造血祖細(xì)胞中特異性表達(dá)[24]。相比于成骨Niche，血管Niche能促進HSC增殖、分化[25]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP可促進成骨細(xì)胞及BMP介導(dǎo)的MSC向成骨細(xì)胞分化時VEGF及Ang1表達(dá)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSC組、HSC+BMP-2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP-2組Ki67及Tie2 mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，MSC組、MSC+BMP-2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP-2組VEGF、Ang1 mRNA相對表達(dá)量逐漸升高，說明BMP-2及BMP-2協(xié)同MSC均可通過促進血管形成而促進HSC增殖。

綜上所述，BMP-2協(xié)同MSC可促進HSC增殖，其機制可能與促血管形成相關(guān)因子VEGF、Ang1和Tie2表達(dá)增加相關(guān)。

參考文獻：

[1] Raynaud CM, Butler JM, Halabi NM, et al. Endothelial cells provide a niche for placental hematopoietic stem/progenitor cell expansion through broad transcriptomic modification[J]. Stem Cell Res, 2013,11(3):1074-1090.

[2] 朱小鳳,黃純蘭,李曉明.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合外源性Shh蛋白對骨髓造血干細(xì)胞增殖影響[J].山東醫(yī)藥,2017,57(37):31-33.

[3] Bai H, Xie YL, Gao YX, et al. The balance of positive and negative effects of TGF-β signaling regulates the development of hematopoietic and endothelial progenitors in human pluripotent stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2013,22(20):2765-2776.

[4] Robin C, Durand C. The roles of BMP and IL-3 signaling pathways in the control of hematopoietic stem cells in the mouse embryo[J]. Int J Dev Biol, 2010,54(6):1189-2000.

[5] Francois S, Eder VV, Belmokhtar K, et al. Synergistic effect of human bone morphogenic protein-2 and mesenchymal stromal cells on chronic wounds through hypoxia-inducible factor-1α induction[J]. Sci Rep, 2017,7(1):42-72.

[6] Rodríguez-Pardo VM,Vernot JP. Mesenchymal stem cells promote a primitive phenotype CD34+c-kit+in human cord blood-derived hematopoietic stem cells during ex vivo expansion[J]. Cell Mol Biol Lett, 2013,18(1):11-33.

[7] Andrade PZ, Santos F, Almeida-Porada G, et al. Systematic delineation of optimal cytokine concentrations to expand hematopoietic stem/progenitor cells in co-culture with mesenchymal stem cells[J]. Mol Biosyst, 2010,6(7):1207-1215.

[8] de Silva CL, Gon?alves R, dos Santos F, et al. Dynamic cell-cell interactions between cord blood haematopoietic progenitors and the cellular niche are essential for the expansion of CD34+, CD34+CD38-and early lymphoid CD7+cells[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2010,4(2):149-158.

[9] Moll NM, Ransohoff RM. CXCL12 and CXCR4 in bone marrow physiology[J]. Expert Rev Hematol, 2010,3(3):315-322.

[10] Chen LZ, Yin SM, Zhang XL, et al. Protective effects of human bone marrow mesenchymal stem cells on hematopoietic organs of irradiated mice[J]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 2012,20(6):1436-1441.

[11] Utsugisawa T, Moody JL, Aspling M, et al. A road map toward defining the role of Smad signaling in hematopoietic stem cells[J]. Stem Cells, 2006,24(4):1128-1136.

[12] Lempereur A, Canto PY, Richard C, et al. The TGFβ pathway is a key player for the endothelial-to-hematopoietic transition in the embryonic aorta[J]. Dev Biol, 2017,12(17):307-320.

[13] Crisan M, Solaimani Kartalaei P, Neagu A, et al. BMP and hedgehog regulate distinct AGM hematopoietic stem cells ex vivo[J]. Stem Cell Reports, 2016,6(3):383-395.

[14] S?derberg SS, Karlsson G, Karlsson S. Complex and context dependent regulation of hematopoiesis by TGF-β superfamily signaling[J]. Ann N Y Acad Sci, 2009(1176):55-69.

[15] Kiel MJ, Morrison SJ. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells[J]. Nat Rev Immunol, 2008,8(4):290-301.

[16] Bhatia M, Bonnet D, Wu D, et al. Bone morphogenetic proteins regulate the developmental program of human hematopoietic stem cells[J]. Exp Med, 1999,189(7):1139-1148.

[17] Detmer K, Walker AN. Bone morphogenetic proteins act synergistically with haematopoietic cytokines in the differentiation of haematopoietic progenitors[J]. Cytokine, 2002,17(1):36-42.

[18] Grassinger J, Simon M, Mueller G, et al. Bone morphogenetic protein (BMP)-7 but not BMP-2 and BMP-4 improves maintenance of primitive peripheral blood-derived hematopoietic progenitor cells (HPC) cultured in serum-free medium supplemented with early actin cytokines[J]. Cytokine, 2007,40(3):165-171.

[19] Su YH, Cai HB, Ye ZY, et al. BMP-7 improved and hematopoietic reconstitution potential of ex vivo expanded cord blood-derived CD34(+) cells[J]. Hum Cell, 2015,28(1):14-21.

[20] Yang XJ, Zhang Y, Yang YL, et al. Vascular endothelial growth factordependent spatiotemporal dual roles of placental growth factor in modulation of angiogenesis and tumor growth[J]. P Natl Acad Sci U S A, 2013,1(10):13932-13937.

[21] Leopol′d AV, Baklaushev VP, Korchagina AA, et al. Ligandreceptor assay for evaluation of functional activity of human recombinant VEGF and VEGFR-1 extracellular fragment[J]. B Exp Biol Med, 2012,152(6):707-711.

[22] Shibuya M. VEGF-VEGFR signals in health and disease[J]. Biomol Ther, 2014,22(1):1-9.

[23] Fagiani E, Christofori G. Angiopoietins in angiogenesis[J]. Cancer Lett, 2013,328(1):18-26.

[24] Makinde T, Agrawal DK. Intra and extravascular transmembrane signalling of angiopoietin-1-Tie2 receptor in health and disease[J]. J Cell Mol Med, 2008,12(3):810-828.

[25] Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2012,12(1):49-60.

[26] Ellis SL, Grassinger J, Jones A, et al. The relationship between bone, hemopoieticstem cells, and vasculature[J]. Blood,2011(18):1516-1524.