基于HPLC指紋圖譜與聚類分析對不同產(chǎn)地連翹質(zhì) 量 評 價

張洪峰 張學(xué)強(qiáng) 于麗霞 陳 晨 王朝宗

（邯鄲市中心醫(yī)院，河北邯鄲056001）

中藥連翹為木犀科連翹屬多年生落葉灌木植物 連 翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的 干 燥 近成熟果實(shí)或成熟果實(shí)的果殼，主要分布于山西、河南、河北、陜西等地，含有苯乙醇苷類、木質(zhì)素類、環(huán)烯醚萜類及黃酮類等多種化學(xué)成分[1-2]。聚類分析（Cluster analysis，CA）是一種理想的多變量統(tǒng)計(jì)技術(shù)，根據(jù)一批樣本的多個指標(biāo)，找出度量樣品之間相似程度的統(tǒng)計(jì)量并作為劃分類型的依據(jù)。樣品間距離用于衡量所研究樣本之間相似性的程度不同（親疏關(guān)系），聚類分析所得到的結(jié)果比傳統(tǒng)分類方法更細(xì)致、全面、合理。近年來，聚類分析已廣泛應(yīng)用于中藥及其制劑分析，屬于化學(xué)計(jì)量學(xué)范疇[3]。如袁會瓊等[4]用聚類分析法結(jié)合HPLC指紋圖譜鑒別云南重樓和長柱重樓，肖榕等[5]用UPLC結(jié)合聚類分析識別不同產(chǎn)地生/制何首烏。連翹含近80種化合物，化學(xué)成分較復(fù)雜[6]，現(xiàn)行中國藥典靠定量測定連翹苷和連翹酯苷A兩個單體成分進(jìn)行質(zhì)量控制，故有必要構(gòu)建連翹藤藥材的指紋圖譜，全面控制其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)擬通過HPLC指紋圖譜結(jié)合聚類分析，探討不同產(chǎn)地連翹藥材的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Shimadzu LC-15C型高效液相色譜儀（Shimadzu公司），包括島津LC-15C泵、SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動進(jìn)樣器、CTO-15C柱溫箱、島津高效液相色譜LC工作站；BSA224S-CW電子天平（德國，Sartorius公司）；SK250HP型超聲提取器（科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；SMART-N15uv超純水機(jī)（香港，Heal Force公司）。

1.2 藥材與試劑 連翹藥材采集地及時間見表1，經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室黃蕓教授鑒定為 連 翹Forsythia suspensa （Thunb.） Vahl的 果實(shí)。甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；水為超純水；冰醋酸為分析純。連翹苷（批號：110821-201615）、連翹酯苷A（批號：111810-201606）、連翹酯苷B（批號：111811-201603）及蘆?。ㄅ枺?00080-201610）均購自中國食品藥品檢定研究院

表1 連翹產(chǎn)地及采收時間

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shimadzu Wondasil C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱。流動相A：0.3%冰醋酸水溶液，流動相B：甲醇，梯度洗脫以甲醇-0.3%冰醋酸為流動相。梯度洗脫：0～20min，10%→26%B；20～35min，26%→38%B；35～50min，38%→60%B；50～60min，60%→10%B。檢測波長：235nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min。理論塔板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 參照物溶液制備 取連翹苷、連翹酯苷A、連翹酯苷B及蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成一定濃度的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過五號篩）約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取按照2.3項(xiàng)下方法制備的同一批連翹藥材（S7）供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次測定，以連翹酯苷A的峰面積和保留時間為參照，對共有峰的相對保留時間和相對峰面積分別進(jìn)行考察，計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.23%，相對峰面積RSD值均小于1.49%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批連翹藥材（S7）6份，取按照2.3項(xiàng)下方法平行制備的供試品溶液，分別進(jìn)樣測定。計(jì)算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.25%，相對峰面積RSD均小于1.48%，表明實(shí)驗(yàn)采用方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批連翹藥材（S7）的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24h測定，記錄色譜圖?？疾旃灿蟹宓南鄬ΡＡ魰r間和相對峰面積RSD值。結(jié)果顯示，共有峰相對保留時間RSD均小于0.39%，相對峰面積RSD均小于1.77%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜構(gòu)建及相似度考察 將所收集的連翹藥材樣本分別處理，制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下方法分析測定，得到各樣本HPLC圖譜，疊加圖見圖1。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）對所獲得的樣本圖譜進(jìn)行處理，色譜峰自動匹配條件設(shè)為：時間窗寬度為0.2s，采用中位數(shù)法生成指紋圖譜。連翹指紋圖譜見圖2，其中有共有峰19個。

所獲得的不同產(chǎn)地樣本HPLC圖譜中，14號峰（連翹酯苷A峰）峰面積較大，分離度良好，保留時間適中，故作連翹酯苷A峰為參照物峰。結(jié)合參比溶液色譜圖，指認(rèn)出其指紋圖譜中4個共有峰。

圖1 不同產(chǎn)地連翹藥材的色譜疊加圖

圖2 連翹指紋圖譜（A）和參比溶液色譜圖（B）（13-連翹酯苷B；14-連翹酯苷A；15-蘆??；18-連翹苷）

表2 20批連翹藥材的相似度

以所獲連翹藥材對照模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見表2。由表2可見樣品S18、S20與對照模式差異最明顯，相似度小于0.9。其他樣品與對照模式差異小，相似度大于0.9。2.6 聚類分析 為了直觀評價20批樣品的質(zhì)量，采用SPSS 22.0系統(tǒng)軟件對樣品共有峰峰面積進(jìn)行聚類分析，采用組間聯(lián)系法，以夾角余弦作為樣品相似性的測度，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，20批樣品基本分為兩大類。圖中顯示聚類趨勢，閾值底層藥材產(chǎn)地較近，隨著閾值增加，氣候與生長條件接近地區(qū)連翹聚為一類。聚類分析結(jié)果與中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計(jì)算的相似度結(jié)果基本類似，兩種方法可以相互驗(yàn)證。

圖3 連翹樣品聚類分析圖

3 討論

中藥指紋圖譜是現(xiàn)在常用的中藥質(zhì)量控制方法之一，能反映出中藥整體質(zhì)量信息，體現(xiàn)了中藥作用的整體性和模糊性。聚類分析屬于化學(xué)計(jì)量學(xué)范疇，能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元分析[5]。連翹是常用大宗中藥材之一，產(chǎn)地多、質(zhì)量差異大。為建立科學(xué)的質(zhì)量評價方法，我們建立了不同產(chǎn)地連翹藥材HPLC-CA指紋圖譜分析方法，指認(rèn)了連翹苷、連翹酯苷A、連翹酯苷B及蘆丁等4個有效成分，通過聚類分析，探討了不同產(chǎn)地連翹質(zhì)量的差異。

連翹所含化學(xué)成分復(fù)雜，藥材質(zhì)量受其所含化學(xué)成分影響較大，文獻(xiàn)和前期的實(shí)驗(yàn)研究均表明，連翹所含成分受采收時間影響較大[2，7]。我們在收集樣品時，集中收集8月下旬到9月上旬樣品，減少時間差異對樣品質(zhì)量的影響。

聚類分析作為復(fù)雜數(shù)據(jù)處理的方法，對于中藥多成分質(zhì)量控制具有較強(qiáng)的應(yīng)用價值。本實(shí)驗(yàn)中樣本聚類分析距離近，說明含有化學(xué)成分及比例相似，質(zhì)量也較接近。聚類遠(yuǎn)近基本表現(xiàn)為地理、氣候等因素差異，可進(jìn)一步解釋中藥產(chǎn)地道地性的內(nèi)涵。聚類分析能夠使實(shí)驗(yàn)樣本分組（分類）情況更加直觀地呈現(xiàn)，相似度計(jì)算結(jié)果呈現(xiàn)的是樣品間差異的定性比較，二者配合使用，能夠使連翹藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加合理，為連翹的臨床合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

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