miR-34a調(diào)控PAX6的表達(dá)增強(qiáng)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的侵襲和遷移

黃玉嬋 吳 峰

(湖北科技學(xué)院眼科，咸寧 437100)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma,RB)是兒童眼科惡性腫瘤中發(fā)病率和致盲率最高的腫瘤，在兒童中發(fā)病率約為0.5‰。不僅影響患兒的視力甚至可能致殘致死[1]。RB也是兒童腫瘤中發(fā)現(xiàn)的第一種與抑癌基因表達(dá)相關(guān)的眼科腫瘤。雖然目前可以通過(guò)手術(shù)加放療提高一定的治愈率，但僅局限于早期病變[2]。所以，RB早期發(fā)現(xiàn)和診斷有重大臨床意義，甚至可以大幅度提高治愈率。所以研究RB侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找早期診斷的相關(guān)分子靶點(diǎn)成為RB研究的重點(diǎn)。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，通過(guò)微小RNA(miRNA)介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控在控制細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中起重要作用[3]。miRNA是一類小的非編碼RNA，其在進(jìn)化過(guò)程中呈現(xiàn)高度保守狀態(tài)，最近已經(jīng)被證明可作為基因表達(dá)的有效調(diào)節(jié)劑。腫瘤抑制miRNA下調(diào)致癌miRNA過(guò)表達(dá)在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用[4]。Katsura等[5]證明膀胱癌組織中miR-34a的表達(dá)水平異常，可影響腫瘤細(xì)胞增殖侵襲等行為。最近的一些研究表明，miR-34a水平在前列腺癌中下調(diào)，對(duì)胃癌和胰腺癌也有一定的調(diào)控作用[6,7]。

PAX6基因是PAX基因家族成員之一，可以編碼轉(zhuǎn)錄基因，在機(jī)體發(fā)育和疾病進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色[8]。PAX6同時(shí)也是一種干細(xì)胞因子，在乳腺癌、胃腸惡性腫瘤中表達(dá)水平升高[9,10]，這表明PAX6可能影響腫瘤的發(fā)展過(guò)程。而且大部分腫瘤的發(fā)生過(guò)程中都存在一定程度的癌基因變異情況，許多相關(guān)因子也參與其過(guò)程，因此研究這些相關(guān)基因的功能及機(jī)制是惡性腫瘤的一種重要治療方向。本研究旨在揭示miR-34a和PAX6在RB中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞系的侵襲、遷移能力的影響，并初步探討其作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標(biāo)本采集及處理 收集2015年1月～2016年1月在我院手術(shù)切除并且經(jīng)病理檢查確診為RB組織50例，同時(shí)取正常視網(wǎng)膜組織50例。RB患者術(shù)前未進(jìn)行放療。腫瘤組織離體后，去除血跡，放入4%多聚甲醛固定。所有組織標(biāo)本的收取均獲得患者本人的同意并簽署知情同意書(shū)，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。

1.1.2細(xì)胞系和主要試劑 人RB細(xì)胞系(Y79、Rb50、Rb44、SM-106)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基。PAX6、p-JAK、p-STAT一抗均購(gòu)自 Abcam(ab233654、ab65524、ab75622)。miR-34a mimic購(gòu)自上海吉?jiǎng)P制藥技術(shù)有限公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué) 將病理組織切片在60℃烤箱中孵育2 h。取出后在梯度酒精中水化15 min，滴加0.3%的H2O2溶液孵育15 min，使用PBS充分沖洗5 min； 滴加0.3% Triton-100，孵育15 min，增加細(xì)胞膜的通透性，使用PBS充分沖洗5 min； 加入配置好的一抗，4℃存放孵育過(guò)夜；吸去抗體，使用PBS充分沖洗5 min； 加入配置好的二抗，37℃孵育15 min，使用PBS充分沖洗5 min； 按照順序加入免疫組化ABC增強(qiáng)液，均在37℃下孵育15 min，加入DAB顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，最后使用梯度酒精脫水后，中性樹(shù)脂封片保存，陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)值免疫組化結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的值:將陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)<5% 算為0分,5%～25% 1分,25%～50%為2分,50%～75%為3分,>75%為4分。然后將染色強(qiáng)度伊陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的值作為評(píng)分，0～1為陰性,2～4為弱陽(yáng)性,5～8為中陽(yáng)性,9～12為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.2.2PCR 熒光定量PCR檢測(cè)miR-34a的表達(dá) 使用miRNA提取試劑盒進(jìn)行miR-34a抽提，實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行，抽提之后，使用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度和純度，最后將其濃度稀釋至50 μg/ml，使用特異性反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)條件按照cDNA合成試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置，均使用U6作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火32 s，循環(huán)50次后檢測(cè)其溶解曲線，檢測(cè)完成后，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。miR-34a引物序列：5′-CACTCTATATAGTGTATCTTTC-3′(正向)和5′-GGCTTTTAGTGTACGTCGTAATG-3′(反向)，U6內(nèi)參引物序列：5′-CCTAGGGAGATTGAGGGGCA-3′(正向)和5′-GGCTATTAGCTTGGAAACGA-3′(反向)。

1.2.3慢病毒載體感染Rb50細(xì)胞 將RB Rb50細(xì)胞置于含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培育，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Rb50細(xì)胞，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染獲得過(guò)表達(dá)miR-34a的細(xì)胞，分別將編碼miR-34a-mimic的慢病毒感染到Rb50細(xì)胞中，以獲得過(guò)表達(dá)miR-XXX的細(xì)胞。并根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)將其轉(zhuǎn)染入細(xì)胞48 h，獲得具有穩(wěn)定表達(dá)的miR-34a克隆細(xì)胞株。

1.2.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將miR-34a DNA片段克隆到ph-TK載體(腎臟熒光素酶)中，同時(shí)使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內(nèi)部對(duì)照。根據(jù) siPORTneoFX使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。 然后根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)，使用雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega，San Luis Obispo，CA)進(jìn)行熒光素酶分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RB細(xì)胞遷移能力 通過(guò)Transwell對(duì)細(xì)胞侵襲能力測(cè)定。將癌細(xì)胞在含有0.1%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 24 h后，將細(xì)胞接種在有基質(zhì)膠的小室中，將具有10%FBS的培養(yǎng)基置于下腔中。在37℃下孵育24 h后，小心地去除上膜表面的細(xì)胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來(lái)水沖洗干凈過(guò)后，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RB細(xì)胞遷移能力 劃痕實(shí)驗(yàn)：將Rb44細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光，劃痕時(shí)易于觀察細(xì)胞遷移狀況，將細(xì)胞接種在6孔板中并培養(yǎng)80%～90%匯合度。用無(wú)菌的200 ml移液管尖端刮擦細(xì)胞單層，產(chǎn)生寬度約1 mm的“傷口” (無(wú)細(xì)胞區(qū)域)。 將用無(wú)菌洗滌液洗滌2次。除去松散的細(xì)胞碎片，并用新鮮培養(yǎng)基更換。 處理前在相差顯微鏡下拍攝傷口的限定區(qū)域。 24、48及72 h后，再次拍攝相同的區(qū)域，并通過(guò)圖像確定剩余的傷口面積。采用傷口實(shí)驗(yàn)期間的初始和最終傷口面積確定傷口閉合率，計(jì)算傷口閉合計(jì)算傷口閉合率=[(初始距離)-(最終距離)/(初始距離)]×100%。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1RB中miR-34a和PAX6的差異性表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示：PAX6定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，在RB組織中表達(dá)水平較高。miR-34a在RB組織中表達(dá)明顯低于正常視網(wǎng)膜組織。50例RB組織中，41例(82%)PAX6表達(dá)陽(yáng)性；50例正常視網(wǎng)膜組織中，11例(22%)PAX6表達(dá)陽(yáng)性(圖1)。表明RB組織中PAX6的表達(dá)明顯高于正常視網(wǎng)膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2miR-34a和PAX6之間的表達(dá)相關(guān)性 PAX6在RB患者和正常人之間的表達(dá)差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-34a和PAX6在RB患者和正常人之間的表達(dá)陽(yáng)性率差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3PAX6在不同RB細(xì)胞株中的表達(dá) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比Rb50、Y79、SM-106細(xì)胞株，PAX6蛋白在Rb44細(xì)胞株中表達(dá)最低(圖2)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取Rb44 RB細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

圖1 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中miR-34a和PAX6的差異性表達(dá)Fig.1 Differential expression of miR-34a and PAX6 in retinoblastomaNote: A.Immunohistochemical staining(×20);B.PCR.*.P<0.05.

2.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-34a與PAX6的靶向關(guān)系 通過(guò)生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)(targetscan)，miR-34a與PAX6蛋白的3′UTR端有相似的結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組比較，RB Rb44轉(zhuǎn)染miR-34a-mimic后，PAX6的mRNA水平明顯降低(圖3B)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PAX6是miR-34a的直接靶點(diǎn)。這提示miR-34a是調(diào)控PAX6的一個(gè)關(guān)鍵因子。

2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-34a后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲能力變化 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示如圖4示：miR-34a-mimic組穿透過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯少于NC組[(186.25±7.75)% vs (47.75±5.76)%,P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-34a的表達(dá)后可以有效抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Rb44細(xì)胞的侵襲能力。

2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-34a后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移能力變化 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5)：與NC組相比，在24、48、72 h時(shí)，miR-34a-mimic組遷移率明顯降低[24 h (18.68±1.21)% vs(36.61±4.21)%，P<0.05;48 h (35.99±5.61)%vs (62.69±8.61)%，P<0.05;72 h (58.61±6.94)% vs (89.51±10.32)%，P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。劃痕實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)miR-34a可以抑制Rb44細(xì)胞的遷移能力。

2.7過(guò)表達(dá)miR-34a后JAK1-STAT3信號(hào)蛋白因子的表達(dá)變化 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-34a-mimic組中p-JAK1和p-STAT3蛋白表達(dá)水平明顯降低[(68.15±6.75)% vs (11.52±4.34)%,(75.15±5.32)% vs (14.39±6.51)%，P<0.05]，非磷酸化JAK1和STAT3的表達(dá)無(wú)明顯變化，PAX6的蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)降低[(71.54±6.75)% vs (19.65±4.34)%]；說(shuō)明miR-34a的過(guò)表達(dá)可以有效下調(diào)信號(hào)通路p-JAK1和p-STAT3蛋白的表達(dá)。

表1視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與正常視網(wǎng)膜組織中PAX6和miR-34a的表達(dá)相關(guān)性

Tab.1CorrelationbetweenmRNAofPAX6andmiR-34ainretinoblastomaandnormalretinatissues

TissuesamplesmiR-34aPAX6PRetinoblastoma11.65%87.48%<0.05Normalretina88.35%12.52%

圖2 PAX6在不同視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.2 Expression of PAX6 in different retinoblastoma cell linesNote: RB50 group compared with other cell lines,*.P<0.05.

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-34a 與PAX6 的靶向關(guān)系Fig.3 Dual luciferase reporter assays verify targeting relationship between miR-34a and PAX6Note: A.Mutation sites between miR-34a and PAX6；B.PAX6 was regulated through miR-34a.Error bars represent standard error.*.P<0.05.

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a的表達(dá)對(duì)Rb44細(xì)胞侵襲行為的作用(結(jié)晶紫染色，×40)Fig.4 Transwell assay to detect effect of miR-34a expression on Rb44 cell invasion(Crystal violet staining,×40)Note: *.P<0.05.

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a的表達(dá)對(duì)RB44細(xì)胞遷移行為的作用Fig.5 Scratch experiment effect of miR-34a expression on migration of RB44 cells was examinedNote: *.P<0.05.

圖6 過(guò)表達(dá)miR-34a后p-JAK1和p-STAT3通路蛋白表達(dá)水平降低Fig.6 Expression of p-JAK1 and p-STAT3 pathway protein was down-regulation after overexpression of miR-34aNote: *.P<0.05.

3 討論

miRNA參與不同的生物學(xué)過(guò)程，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生。 miRNA也被稱為細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子，最近報(bào)道m(xù)iR-34a是一種腫瘤抑制因子[11-13]。miR-34a可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt(磷脂酰肌醇3-激酶/Akt)和MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同抑制[14,15]。最近，在鼻咽癌和結(jié)腸直腸癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)異常[16,17]。然而，miR-34a在調(diào)節(jié)RB進(jìn)展中的作用不是很清楚。第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 miR-34a在視RB細(xì)胞中呈現(xiàn)出較低的表達(dá)水平，提示miR-34a的低表達(dá)可能與RB細(xì)胞的維持和自我更新有一定的關(guān)系。

PAX6是配對(duì)體基因家族的成員之一，其可以作為轉(zhuǎn)錄因子參與多種細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程[18]。 PAX6首先在1991年被發(fā)現(xiàn)，是由422個(gè)氨基酸的多肽產(chǎn)物組成，其具有N-末端配對(duì)結(jié)構(gòu)域(PD)，中間的同源結(jié)構(gòu)域(HD)和富含絲氨酸/蘇氨酸的C-末端結(jié)構(gòu)域，所有結(jié)構(gòu)基序具有轉(zhuǎn)錄因子的特征[19]。 PAX6的功能研究發(fā)現(xiàn)其與垂體腺，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和胰腺胰島細(xì)胞的發(fā)育相關(guān)[20]。作為早期分化標(biāo)記，PAX6也用于鑒定目前干細(xì)胞研究中神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的前體構(gòu)成[21]。PAX6在不同腫瘤中通過(guò)作用于不同信號(hào)通路發(fā)揮不同的作用，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中PAX6的具體作用和作用機(jī)制尚未有研究詳細(xì)闡述。

JAK1和STAT3是屬于JAK/STAT家族中的轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，當(dāng) STAT3發(fā)生磷酸化的時(shí)候形成二聚體，并轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核與染色體上靶基因啟動(dòng)子進(jìn)行結(jié)合，誘導(dǎo)位于其下游的基因即靶基因轉(zhuǎn)錄激活[22]。同時(shí)磷酸化的STAT3可以調(diào)控細(xì)胞G1/S期及G2/M 期的調(diào)控因子使細(xì)胞生存周期延長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變[23]。STAT3和 P-STAT3在多種惡性腫瘤如肝癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌中均有異常表達(dá)，且持續(xù)高水平的 STAT3表達(dá)可引發(fā)其下游腫瘤相關(guān)基因的激活及表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、新生血管形成及新陳代謝以及抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生[24,25]。

本實(shí)驗(yàn)是研究在體外環(huán)境下miR-34a靶向PAX6在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明miR-34a可以靶向PAX6調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的生物學(xué)行為，且miR-34a 可能通過(guò)PAX6的表達(dá)而起到對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的抑制作用。而后面繼續(xù)通過(guò)Western blot驗(yàn)證過(guò)表達(dá)miR-34a后JAK/STAT信號(hào)通路蛋白水平的變化顯示，miR-34a過(guò)表達(dá)后可能通過(guò)降低PAX6的表達(dá)下調(diào)p-JAK1和p-STAT3的蛋白水平，進(jìn)而影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的侵襲和遷移。

本研究表明miR-34a在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)降低，而PAX6在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)明顯增高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-34a可以靶向調(diào)控PAX6的表達(dá)，通過(guò)JAK1/STAT3信號(hào)通路調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。提示miR-34a和PAX6可能參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)展過(guò)程，有可能成為預(yù)測(cè)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生和進(jìn)展的標(biāo)志物。

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