苦參堿對oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞炎癥反應(yīng)及增殖凋亡的影響及分子機制研究

盧迎宏 王 丹 井海云

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院心血管內(nèi)科,鄭州 450007)

動脈粥樣硬化是一種大量脂質(zhì)沉積在動脈管壁形成脂肪條紋而后逐漸發(fā)展成粥樣斑塊并引發(fā)多種并發(fā)癥的慢性動脈疾病，主要并發(fā)癥包括：缺血性心臟病、外周動脈疾病及缺血性中風(fēng)等心血管疾病[1]。目前心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病[2]，每天約有2 200名美國人死于心血管疾病相當(dāng)于平均每40 s就有1例心血管疾病死亡病例[3]。而且心血管疾病發(fā)病率還在不斷上升，到2030年預(yù)計會達到40.5%，到那時這些患者的直接醫(yī)療費用總額估計將達到8 180億[4]。動脈粥樣硬化是造成心血管疾病高發(fā)病率和高死亡率的主要原因[5,6]。因此，尋找抗動脈粥樣硬化的藥物有利于心血管疾病的預(yù)防和治療?？鄥A是傳統(tǒng)中草藥苦參中的主要活性成分[7]。苦參堿屬于生物堿類，結(jié)構(gòu)式見圖1A?？鄥A具有廣泛的生物學(xué)功能，如抗腫瘤活性、抗炎作用、抗病毒活性、鎮(zhèn)痛作用及抗菌活性等[8]。有研究表明苦參堿可抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞黏附分子的表達，具有潛在的預(yù)防動脈粥樣硬化病變的作用[9]。Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)苦參堿可抑制擾流情況下血管平滑肌細胞的遷移，具有治療剪切力相關(guān)的血管再狹窄的潛能。本文著重探討苦參堿對oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞炎癥反應(yīng)及增殖凋亡的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞系及主要試劑 人主動脈血管平滑肌細胞系T/G HAVSMC購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。苦參堿購自美國Sigma公司。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)購自美國Kalen Biomedical公司。JAK/STAT3通路抑制劑Ruxolitinib購自Selleck公司。SmGM-2培養(yǎng)基購自瑞士Lonza龍沙公司。胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。RNA提取試劑盒RNAiso Plus reagent購自大連TaKaRa公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司。增殖標(biāo)記蛋白細胞增殖核抗原-67(Antigen identified by monoclonal antibody,Ki-67)和增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，細胞凋亡標(biāo)記蛋白 B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2,Bcl-2) 和Bcl-2相關(guān)蛋白X(Bcl-2-associated X protein,Bax)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子5(Signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的抗體購自NEB公司。

圖1 苦參堿對血管平滑肌細胞活力的影響Fig.1 Effect of matrine on cell viabilityNote: A.Chemical structure of matrine；B.Cell viability was detected by CCK-8.

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物處理 人主動脈血管平滑肌細胞T/G HAVSMC于SmGM-2培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)中置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。不同濃度苦參堿處理人主動脈血管平滑肌細胞24 h和48 h后，用CCK-8檢測細胞活力以篩選合適的苦參堿濃度進行后續(xù)實驗。用oxLDL(50 mg/ml)處理T/G HAVSMC細胞24 h建立動脈粥樣硬化模型，對照組用生理鹽水進行處理。

1.2.2脂質(zhì)代謝指標(biāo)檢測 1 mg/ml苦參堿分別處理對照組和造模組后收集各組細胞上清，運用熒光酶標(biāo)儀按照Amplex Red Cholesterol kit試劑盒說明書檢測細胞上清中總膽固醇(Totalcholesterol,TC)、游離膽固醇(Free cholesterol， FC) 和膽固醇脂(Cholesteryl ester,CE)。

1.2.3實時定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 首先提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)成cDNA，最后以cDNA為模板進行qRT-PCR。白細胞介素1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)上游引物：AAGATGGAAAAGCGGTTTG，IL-1β下游引物：GGGAAGGCATTAGGAATAG。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α) 上游引物：CCCAATCTGTGTCCTTCTA，TNF-α下游引物：CACTACTTCAGCGTCTCGT。IL-10上游引物：GCCAGG GCACCCAGTCTGAG，IL-10下游引物：ACAGCGCCGTAGCCTCAGCC。IL-13上游引物：GGCAGCATGGTATGGAGCATCAAC，IL-13下游引物：GCAGAAT-CCGCTCAGCATCCTC。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM說明書進行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.2.4CCK-8檢測細胞增殖 苦參堿分別處理對照組和造模組后CCK-8檢測各組細胞增殖倍數(shù)。檢測前用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋到10%，待測細胞用上述稀釋液制成1×106個/ml的細胞懸液，37℃培養(yǎng)1～4 h后450 nm處檢測吸光值。

1.2.5流式細胞術(shù)分析細胞凋亡 收集各組人主動脈血管平滑肌細胞，待測細胞用1×Binding buffer制成1×106個/ml的細胞懸液。再用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)進行染色15 min。最后利用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測并計算細胞凋亡率。

1.2.6蛋白印跡 收集各組細胞，用PBS洗3次后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%的BSA封閉后，依次孵育相應(yīng)的一抗和二抗。最后進行顯色并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS16.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。兩兩比較用獨立樣本的t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1苦參堿對T/G HAVSMC細胞活力的影響 不同濃度(0.5～10 mg/ml)的苦參堿處理T/G HAVSMC細胞24 h和48 h后檢測細胞活力。如圖1B所示，苦參堿濃度在1 mg/ml以下時，細胞活力幾乎不受影響，可保持在90%以上?？鄥A濃度高于1 mg/ml后細胞活力會隨著苦參堿濃度的升高而降低。上述結(jié)果表明，低濃度(<1 mg/ml)的苦參堿不會對細胞活力造成影響，高濃度(>1 mg/ml)的苦參堿會降低細胞活力。后續(xù)實驗選擇1 mg/ml的苦參堿對T/G HAVSMC細胞進行處理。

2.2苦參堿在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中對脂質(zhì)代謝的影響 為了分析在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中苦參堿對脂質(zhì)代謝的影響，分別檢測各組細胞培養(yǎng)上清中TC、FC和CE的濃度。如圖2所示，與對照組相比，造模組的TC、FC和CE的濃度顯著升高(P<0.01)。對照組和對照加藥組TC、FC和CE的濃度無明顯差異。與造模組相比，模型加藥組TC、FC和CE的濃度明顯降低(P<0.05)。這說明，苦參堿可以改善動脈粥樣硬化模型中的脂質(zhì)代謝異常。

2.3苦參堿在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中對炎癥因子的影響 利用qRT-PCR檢測各組細胞中促炎因子IL-1β和TNF-α及抗炎因子IL-10和IL-13的mRNA水平。圖3顯示，造模組促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平遠遠高于對照組(P<0.001)，抗炎因子IL-10和IL-13的mRNA水平則顯著低于對照組(P<0.01)。促炎因子IL-1β和TNF-α及抗炎因子IL-10和IL-13在對照組和對照加藥組中無明顯差異。與造模組相比，模型加藥組促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平大大降低(P<0.01)，抗炎因子IL-10和IL-13的mRNA水平明顯升高(P<0.05)。由此可見，苦參堿在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中具有抗炎作用。

圖2 苦參堿對脂質(zhì)代謝的影響Fig.2 Effect of matrine on cell lipid metabolismNote: Versus control group，**.P<0.01，***.P<0.001；versus model group，#.P<0.05，##.P<0.01.

圖3 QRT-PCR檢測炎癥因子mRNA水平Fig.3 mRNA level of inflammatory factor was detected by qRT-PCRNote: Versus control group，**.P<0.01,***.P<0.001;versus model group，#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001.

2.4苦參堿在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中對細胞增殖的影響 為了分析苦參堿對血管平滑肌細胞增殖的影響，每天檢測各組細胞增殖倍數(shù)。由圖4可知，與對照組相比，苦參堿處理3 d開始，造模組細胞增殖倍數(shù)明顯升高(P<0.05)，處理4 d時造模組細胞增殖倍數(shù)顯著增多(P<0.01)，處理5 d以后造模組細胞增殖倍數(shù)大大提高(P<0.001)。對照組和對照加藥組的細胞增殖倍數(shù)無明顯變化。與造模組相比，模型加藥組在苦參堿處理第4天時細胞增殖倍數(shù)明顯降低(P<0.01)，處理5 d以后模型加藥組細胞增殖倍數(shù)顯著減少(P<0.05)。以上結(jié)果說明，苦參堿可以抑制動脈粥樣硬化模型中人主動脈平滑肌細胞增殖能力的提高。

圖4 CCK-8檢測細胞增殖Fig.4 Cell proliferation was tested by CCK-8Note: Versus control group，*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001；versus model group，#.P<0.05，##.P<0.01.

圖5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡Fig.5 Apoptosis was detected by flow cytometryNote: A.Scatter diagram of flow cytometry；B.Histogram of flow cytometry.Versus control group，***.P<0.001；versus model group,##.P<0.01.

2.5苦參堿在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中對細胞凋亡的影響 利用流式細胞術(shù)分析苦參堿在細胞凋亡方面的作用。從圖5A中可以看出，造模組凋亡細胞數(shù)明顯高于其他三組。由圖5B可知，造模組細胞凋亡率遠遠大于對照組(P<0.001)。對照組和對照加藥組細胞凋亡率無明顯差異。模型加藥組細胞凋亡率顯著低于造模組(P<0.01)。上述結(jié)果表明，苦參堿可以減弱動脈粥樣硬化模型中人主動脈平滑肌細胞凋亡的增加。

2.6苦參堿對細胞增殖和凋亡標(biāo)記蛋白表達的影響 為進一步證實苦參堿在動脈粥樣硬化中對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響，利用蛋白印跡檢測各組細胞增殖標(biāo)記蛋白Ki-67和PCNA及凋亡標(biāo)記蛋白Bcl-2和Bax的表達。圖6A顯示，造模組Ki-67、PCNA和Bax的表達明顯高于其他三組，Bcl-2則低于其他三組。模型加藥組Ki-67、PCNA和Bax的表達低于造模組，Bcl-2高于造模組。由圖6B可知，與對照組相比，造模組Ki-67、PCNA和Bax的表達顯著升高，Bcl-2顯著降低(P<0.01)。對照組和對照加藥組增殖和凋亡標(biāo)記蛋白表達無明顯變化。與造模組相比，模型加藥組Ki-67、PCNA和Bax的表達明顯減少，Bcl-2表達明顯增多(P<0.05)。由此可見，苦參堿在動脈粥樣硬化中可以抑制血管平滑肌細胞增殖和凋亡標(biāo)記蛋白表達的異常。

2.7苦參堿抑制oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中JAK/STAT3通路的活化 為探討苦參堿在動脈粥樣硬化中的調(diào)控機制，蛋白印跡檢測JAK/STAT3通路上STAT3、p-STAT3、STAT5和p-STAT5的蛋白水平。如圖7A所示，各組細胞中STAT3和STAT5的蛋白水平無明顯差異。造模組p-STAT3和p-STAT5的蛋白水平明顯高于其他三組。圖7B顯示，造模組p-STAT3和p-STAT5相對蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.01)。對照組和對照加藥組p-STAT3和p-STAT5相對蛋白表達量無明顯變化。與造模組相比，模型加藥組p-STAT3和p-STAT5相對蛋白表達量明顯減少(P<0.05)。以上結(jié)果說明，在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中，STAT3和STAT5磷酸化水平升高，苦參堿處理會抑制JAK/STAT3通路的活化。

圖6 蛋白印跡檢測細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達Fig.6 Expression of cell proliferation and apoptosis marker proteins was tested by Western blotNote: A.Representative photograph of Western blot；B.Histogram of Western blot.Versus control group,**.P<0.01；versus model group,#.P<0.05.

2.8苦參堿通過JAK/STAT3通路影響oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中細胞增殖和凋亡 利用JAK/STAT3通路抑制劑Ruxolitinib進一步分析苦參堿影響oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中細胞增殖和凋亡的機制。圖8A顯示，造模組Ki-67、PCNA和Bax的表達明顯高于其他四組，Bcl-2表達則低于其他四組。由圖8B和8C可知，與對照組相比，造模組Ki-67、PCNA和Bax的表達明顯升高，Bcl-2明顯降低(P<0.05)。與造模組相比，模型加藥組和模型+Ruxolitinib組Ki-67、PCNA和Bax的表達明顯減少，Bcl-2表達明顯增多(P<0.05)；模型加藥+Ruxolitinib組Ki-67、PCNA和Bax的表達顯著減少，Bcl-2表達顯著增多(P<0.01)。由此可見，苦參堿可通過抑制JAK/STAT3通路活化減弱oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中細胞增殖和凋亡的增加。

圖7 蛋白印跡檢測JAK/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達Fig.7 Expression of JAK/STAT3 signal pathway related proteins was tested by Western blotNote: A.Representative photograph of Western blot；B.Histogram of Western blot.Versus control group；**.P<0.01;versus model group,#.P<0.05.

圖8 蛋白印跡檢測細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達Fig.8 Expression of cell proliferation and apoptosis marker proteins was tested by Western blotNote: A.Representative photograph of Western blot；B.Histogram of Western blot.Versus control group,*.P<0.05，**.P<0.01;versus model group，#.P<0.05,##.P<0.01.

2.9苦參堿通過JAK/STAT3通路影響oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中炎癥因子的表達 為進一步分析若參堿在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中抗炎作用的分子機制，添加JAK/STAT3通路抑制劑Ruxolitinib檢測各組細胞中促炎因子IL-1β和TNF-α及抗炎因子IL-10和IL-13的mRNA水平。如圖9A和9B所示，與對照組相比，造模組IL-1β和TNF-α的mRNA水平顯著升高，IL-10和IL-13的mRNA水平顯著降低(P<0.01)。與造模組相比，模型加藥組和模型+Ruxolitinib組及模型加藥+Ruxolitinib組IL-1β和TNF-α的mRNA水平都明顯降低，IL-10和IL-13的mRNA水平都明顯升高(P<0.05)。上述結(jié)果表明，在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中，苦參堿可通過抑制JAK/STAT3通路活化發(fā)揮抗炎作用。

3 討論

動脈粥樣硬化的病理機制是一個十分復(fù)雜的過程，炎癥反應(yīng)及血管平滑肌細胞不受控地增殖和過度凋亡是動脈粥樣硬化加劇的主要因素[11]。目前針對動脈粥樣硬化的治療策略主要包括生活方式的改變，降膽固醇和降血壓藥物，抗炎癥和抗血栓等藥物及外科手術(shù)[12]。例如煙酸可通過抑制血管炎癥和血管平滑肌細胞的凋亡來抑制動脈粥樣硬化進程[13]。但這些治療效果并不理想，尋找安全、副作用小的治療藥物十分必要。

圖9 QRT-PCR檢測炎癥因子mRNA水平Fig.9 mRNA level of inflammatory factor was detected by qRT-PCRNote: A.Relative mRNA level of pro-inflammatory factor；B.Relative mRNA level of anti-inflammatory cytokine.Versus control group，**.P<0.01，***.P<0.001；versus model group，#.P<0.05，##.P<0.01.

許多中草藥提取物都具有抗炎的作用。有文獻報道淫羊藿苷可以減低大鼠海馬組織中促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平起到抗炎的作用[14]。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)6.25 μmol/L和12.5 μmol/L的姜黃素可以明顯降低oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平的增加而減輕炎癥反應(yīng)。有數(shù)據(jù)顯示白藜蘆醇和黃芩苷在動脈粥樣硬化中也具有抗炎的作用[16,17]。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)在高果糖誘導(dǎo)的脂肪性肝炎中苦參堿可抑制高果糖引發(fā)的TNF-α水平的升高，發(fā)揮抗炎作用。有文獻報道在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎中苦參堿可以降低促炎因子IL-1β和TNF-α水平的升高[19]。有數(shù)據(jù)顯示苦參堿可以降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥因子TNF-α和IL-1β水平的升高，抑制炎癥反應(yīng)[20]。Gong等[21]研究表明苦參堿在長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛模型中可以減弱促炎因子IL-1β和TNF-α的表達，促進抗炎因子IL-10 的表達。與前人結(jié)果類似，本文結(jié)果顯示，在oxLDL處理T/G HAVSMC細胞建立的動脈粥樣硬化模型中，促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平升高，抗炎因子IL-10和IL-13的mRNA水平降低。1 mg/ml苦參堿可以抑制T/G HAVSMC促炎因子水平的升高和抗炎因子水平的降低。由此可見，苦參堿在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中具有抗炎作用。

血管平滑肌細胞增殖和凋亡的異常有助于動脈粥樣硬化斑塊的形成而加劇動脈粥樣硬化進程[22,23]。大量研究表明多種中草藥提取物可以改變細胞增殖和凋亡。Mair等[24]發(fā)現(xiàn)胡椒堿可以有效抑制血管平滑肌細胞增殖。有文獻報道青蒿素可以抑制血管平滑肌細胞增殖并減弱PCNA的表達[25]。從蘇木中提取的巴西木素可以降低血管平滑肌細胞增殖，具有成為治療血管疾病藥物的潛能[26]。有研究表明黃芩苷可以有效抑制血小板生長因子誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖起到抗動脈粥樣硬化的功能[27]。Jang等[28]發(fā)現(xiàn)一種大當(dāng)歸乙醇提取物可以通過抑制血管平滑肌細胞增殖來改善動脈粥樣硬化。據(jù)報道苦參堿可以抑制結(jié)直腸癌及肝癌細胞增殖[29,30]。在髓母細胞瘤細胞中苦參堿也具有抑制細胞增殖的功能[31,32]。有文獻報道苦參堿以一種劑量依賴性的方式抑制血管平滑肌細胞增殖[33]。本文結(jié)果表明，在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中，T/G HAVSMC的增殖和凋亡都大大提高，Ki-67、PCNA和Bax表達顯著升高，Bcl-2顯著降低。1 mg/ml苦參堿可以減弱oxLDL誘導(dǎo)的細胞增殖，凋亡的增加和Ki-67、PCNA和Bax表達的升高及Bcl-2表達的降低。上述結(jié)果說明，苦參堿可以改善動脈粥樣硬化模型中血管平滑肌細胞增殖和凋亡的升高。

JAK/STAT3信號通路在細胞增殖和凋亡方面起著重要的調(diào)控作用。Gritsina等[34]認為抑制JAK/STAT3信號通路可以作為一種卵巢癌治療的新策略。有研究表明0.5 mg/ml的苦參堿可以降低慢性骨髓性白血病細中JAK/STAT3信號通路上相關(guān)蛋白的磷酸化水平，抑制細胞生長[35]。Yang等[36]發(fā)現(xiàn)苦參堿可通過抑制JAK/STAT3信號通路中JAK2和STAT3的磷酸化抑制膽管癌細胞增殖起到抗腫瘤的功能。本文結(jié)果顯示，在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中，STAT3和STAT5磷酸化水平升高。1 mg/ml苦參堿可以減弱STAT3和STAT5磷酸化水平的升高。而且，苦參堿與JAK/STAT3通路抑制劑Ruxolitinib均可抑制增殖和凋亡標(biāo)記蛋白表達的異常，促炎因子水平的升高和抗炎因子水平的降低。由此可見，苦參堿處理可抑制動脈粥樣硬化模型中JAK/STAT3通路的活化發(fā)揮抗炎和抑制血管平滑肌細胞增殖和凋亡的作用。

本研究表明，在oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中，苦參堿可以改善脂質(zhì)代謝異常，抑制炎癥反應(yīng)，減弱人主動脈平滑肌細胞增殖和凋亡，抑制JAK/STAT3通路上STAT3和STAT5磷酸化水平升高。苦參堿與JAK/STAT3通路抑制劑Ruxolitinib均可改善增殖和凋亡標(biāo)記蛋白表達的異常，抑制促炎因子水平的升高和抗炎因子水平的降低。綜上所述，苦參堿可通過抑制JAK/STAT3通路的活化來起到抗炎和抑制血管平滑肌細胞增殖和凋亡的作用。下一步計劃在體內(nèi)探索苦參堿對動脈粥樣硬化的影響，為動脈粥樣硬化新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

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