人參皂苷Rb1通過抑制JNK信號通路改善糖尿病大鼠肝臟糖脂代謝異常*

曹 萌

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內分泌二病區(qū)，新鄉(xiāng) 453100)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝疾病，嚴重威脅著人類的健康。糖尿病發(fā)病率一直處于上升趨勢，2010年全球發(fā)病率為6.4%，預計到2030年發(fā)病率將上升到7.7%[1]。2015年全球有4.15億多的成人患有糖尿病，預計到2040年將增加至6.42億人[2]。隨著經濟的發(fā)展和人口轉型，中國糖尿病發(fā)病率在過去30年呈現(xiàn)大幅度的上升，從二十世紀八十年代的1%到2001年的5.5%，到2010年發(fā)病率已增加到11.6%。大約1.14億中國成人患有糖尿病，而且前驅糖尿病發(fā)病率也在不斷上升，中國已成為糖尿病患者最多的國家[3]。據(jù)Luciana Scalone統(tǒng)計，平均每例糖尿病每年約花費3 315歐元，藥品費用占31.5%[1]。開發(fā)糖尿病新藥具有重要意義。人參作為藥用植物已具有五千多年的歷史，人參皂苷是人參的主要活性成分，屬于固醇類化合物三萜皂苷，具有抗氧化、抗衰老、抗癌癥、生理調節(jié)及其他提升健康的活性[4]。已有文獻報道人參皂苷Rb1具有促進神經纖維的形成，促進血清蛋白質的合成，促進膽固醇的合成和分解，抑制中性脂肪的分解及抗溶血反應等作用[5]。本文主要探索人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠肝臟糖脂代謝的影響及其調控機制。

1 材料與方法

1.1動物及主要試劑 30只7周齡SD大鼠購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究中心。鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)和人參皂苷Rb1購自美國sigma公司。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色試劑盒和Accu-check活力血糖儀購自美國羅氏公司。放射免疫分析試劑盒購自北京科美生物技術有限公司。血脂檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。JNK1、c-Jun、IL-6、IL-1β和TNF-α的抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1糖尿病大鼠模型的建立 30只大鼠隨機平均分為3組，分別為健康對照組(n=10)、 STZ誘導組(n=10)、STZ+人參皂苷Rb1組 (n=10)。STZ誘導組和STZ+人參皂苷Rb1組腹腔注射STZ (60 mg/kg)，連續(xù)5 d，尾靜脈取血。若血糖水平連續(xù)3 d超過12 mmol/L則判定為糖尿病模型建立成功，健康對照組注射同體積的生理鹽水。建模成功后STZ+人參皂苷Rb1組給予人參皂苷Rb1 (10 mg/kg)，健康對照組和STZ誘導組給予同體積的生理鹽水。

1.2.2蘇木素伊紅(HE)染色 頸椎脫臼法處死大鼠后取出肝臟組織后用PBS清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊。用4%的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50%和70%的酒精依次清洗。去除酒精脫水機中脫水，然后進行石蠟包埋，切片。按照蘇木素伊紅(HE)染色液說明書進行HE染色。光鏡下肝臟組織病理情況。

1.2.3TUNEL染色 石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后用蛋白酶K于21～37℃處理15～30 min。PBS漂洗3次后晾干，滴加TUNEL反應混合液于標本上后，在暗盒中37℃反應1 h。PBS漂洗3次晾干滴加辣根過氧化物酶結合的POD于標本上后，在暗盒中37℃反應30 min。PBS漂洗后在組織處滴加DAB底物，15～25℃反應10 min。PBS漂洗后蘇木素復染幾秒后自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照，細胞核呈棕色顆粒的為陽性細胞。

1.2.4糖代謝指標檢測 收集尾靜脈血液，用羅氏Accu-check活力血糖儀檢測各組大鼠血糖濃度。用放射免疫分析試劑盒檢測胰島素和C肽水平。

1.2.5脂質代謝指標檢測 運用全自動化生分析儀按照試劑盒說明書測定總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇濃度。

1.2.6蛋白印跡 收集待測組織細胞，用PBS洗3次后加入已添加蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解，之后進行總蛋白的提取。然后等量的蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜，用5%的BSA進行封閉后，依次孵育一抗和二抗，最后進行顯色。

1.2.7免疫組化 首先石蠟切片經脫蠟和水化后用1% 的triton-100處理15 min，3%的H2O2處理15 min，PBS漂洗3次后進行抗原修復。然后經5%的羊血清封閉30 min后依次孵育一抗和二抗。最后進行染色封片。

1.3統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析用SPSS 16.0軟件進行，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05認為存在明顯差異。

2 結果

2.1人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠肝損傷的影響 通過HE染色觀察肝病理和TUNEL染色檢測肝細胞凋亡情況，分析人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠肝損傷的影響。圖1A顯示，健康對照組大鼠肝組織結構清晰，肝細胞排列規(guī)則，胞漿深染。STZ誘導組的糖尿病大鼠肝細胞索結構紊亂，可見大小不一的脂滴空泡，出現(xiàn)大量紅細胞彌散。STZ+人參皂苷Rb1組肝組織病變明顯減輕。由圖1B可知，STZ誘導組的糖尿病大鼠肝細胞凋亡明顯高于健康對照組。與STZ誘導組相比，STZ+人參皂苷Rb1組肝細胞凋亡大大降低。上述結果表明，人參皂苷Rb1可改善STZ誘導的糖尿病大鼠肝損傷。

2.2人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠糖代謝的影響 為分析人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠糖代謝的影響，分別檢測血糖，胰島素及C肽三個指標。如圖2A所示，STZ誘導組的糖尿病大鼠血糖濃度明顯高于健康對照組(P<0.05)。STZ+人參皂苷Rb1組的血糖濃度明顯低于STZ誘導組(P<0.05)。圖2B、C顯示，STZ誘導組的糖尿病大鼠胰島素及C肽濃度明顯低于健康對照組(P<0.05)。與STZ誘導組的糖尿病大鼠相比，STZ+人參皂苷Rb1組的胰島素及C肽濃度明顯升高(P<0.05)。由此可見，人參皂苷Rb1可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠血糖的升高和胰島素及C肽濃度的降低，改善STZ誘導的糖尿病大鼠糖代謝異常。

圖1 肝病理檢測(A)和肝細胞凋亡檢測(B)Fig.1 Pathological detection (A) and apoptosis assay (B) of liverNote: A.HE staining，×200；B.TUNEL staining，×400.

圖2 血糖、胰島素和C肽水平檢測Fig.2 Level of blood glucose,insulin and C-peptideNote: A.Blood glucose,B.Insulin,C.C-peptide.*.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs STZ-induced group.

2.3人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠脂代謝的影響 為分析人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠脂質代謝的影響，利用全自動化生化分析儀檢測總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇。如圖3A～D所示，STZ誘導組的糖尿病大鼠總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇明顯高于健康對照組；高密度脂蛋白膽固醇低于健康對照組(P<0.05)。與STZ誘導組的糖尿病大鼠相比，STZ+人參皂苷Rb1組的總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇明顯降低；高密度脂蛋白膽固醇升高(P<0.05)。上述結果表明，人參皂苷Rb1可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇的升高和高密度脂蛋白膽固醇的降低，緩解STZ誘導的糖尿病大鼠脂質代謝異常。

2.4人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠JNK信號通路相關蛋白表達的影響 進一步探索人參皂苷Rb1調控糖尿病大鼠糖脂代謝的分子機制，蛋白印跡檢測JNK信號通路相關蛋白JNK1和c-Jun的表達。圖4A顯示，STZ誘導組的糖尿病大鼠JNK1和c-Jun的表達高于其他兩組。統(tǒng)計灰度值計算相對表達量，由圖4B、C可知，STZ誘導組的JNK1和c-Jun蛋白相對表達量明顯高于健康對照組(P<0.05)。與STZ誘導組相比，STZ+人參皂苷Rb1組JNK1和c-Jun蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05)。由此可見，人參皂苷Rb1可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠JNK信號通路相關蛋白JNK1和c-Jun表達的升高。

圖3 脂質代謝指標檢測Fig.3 Level of blood lipidNote: A.TG；B.TC；C.LDL-C；D.HDL-C.*.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs STZ-induced group.

圖4 蛋白印跡檢測JNK信號通路相關蛋白表達Fig.4 Expression of JNK signal pathway related proteins was tested by Western blotNote: A.The representative photograph of Western blot；B.Histogram represents the statistical analysis of JNK1；C.Histogram represents the statistical analysis of c-Jun.*.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 STZ-induced group.

2.5人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠炎癥因子的影響 為分析人參皂苷Rb1對糖尿病大鼠炎癥反應的影響，免疫組化檢測炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表達情況。圖5A顯示，炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α在STZ誘導組中表達最高。如圖5B所示，STZ誘導組的IL-6、IL-1β和TNF-α陽性細胞數(shù)目明顯高于健康對照組(P<0.05)。與STZ誘導組相比，STZ+人參皂苷Rb1組IL-6、IL-1β和TNF-α陽性細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。上述結果表明，人參皂苷Rb1可減弱STZ誘導的糖尿病大鼠炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達，抑制肝臟炎癥反應。

圖5免疫組化檢測炎癥因子表達

Fig.5Expressionofinflammatoryfactorwasdetectedbyimmunohistochemistry

Note: A.The representative photograph of immunohistochemistry,B.Histogram represents the statistical analysis of IL-6,IL-1β and TNF-α.*.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 STZ-induced group.

3 討論

據(jù)報道，糖尿病患者出現(xiàn)高血壓、中風、眼病、腎病、下肢截肢及心肌梗死等疾病的風險較高[6]。這些糖尿病并發(fā)癥是造成高死亡率的原因之一。據(jù)統(tǒng)計，全球有近480萬人死于糖尿病，給全球衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了嚴重的負擔[7,8]。糖尿病已成為最主要的非傳染性慢性疾病之一[9]。糖尿病患者常會發(fā)生糖脂代謝異常、肥胖、炎癥等癥狀[10]。大量文獻報道了許多植物提取物可改善糖脂代謝異常及炎癥反應等現(xiàn)象，對疾病的治療有很好的促進作用。

高血糖是糖尿病的主要特征，多種植物提取物具有逆轉糖代謝異常的作用已被大量研究證實。Ren等[11]發(fā)現(xiàn)從桑葉中提取的多糖可抑制2型糖尿病大鼠血糖的升高及胰島素的降低。據(jù)報道一種百金花屬植物提取物可抑制糖尿病大鼠血糖濃度的升高[12]。有數(shù)據(jù)顯示黃連素可減弱糖尿病大鼠中血糖的升高[13]。Hwang等[14]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Compound K可降低2型糖尿病OLETE大鼠血糖濃度，改善糖代謝的異常。有研究顯示人參皂苷Re可降低高脂飼養(yǎng)小鼠引發(fā)的血糖濃度的升高[15]。據(jù)報道人參皂苷Rb1可改善肥胖糖尿病小鼠糖代謝的異常[16]。本文結果顯示，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，人參皂苷Rb1可抑制血糖的升高和胰島素及C肽濃度的降低，改善糖代謝異常。

脂質代謝異常也是糖尿病的常見癥狀。大量文獻已證實多種植物提取物可改善各類疾病的脂質代謝異常。Hao等[17]研究表明，虎杖苷可抑制糖尿病大鼠模型中總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平的升高。有數(shù)據(jù)顯示，辣木葉甲醇提取物可減弱四氧嘧啶誘導的糖尿病大鼠模型中總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平的升高和高密度脂蛋白膽固醇的降低[18]。Hooda等[19]研究表明，山柑藤根乙醇提取物可降低STZ誘導的糖尿病大鼠總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平的升高和高密度脂蛋白膽固醇的降低。有研究顯示高麗紅參提取物可抑制高脂飼養(yǎng)的小鼠總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平的升高，改善脂代謝異常[20]。有研究顯示，姜黃素可抑制2型糖尿病大鼠總膽固醇及三酰甘油水平的升高[21]。Kang等[22]發(fā)現(xiàn)人參皂苷20(S)-Rg3可降低2型糖尿病大鼠總膽固醇、三酰甘油水平的升高。與前人結果類似，本文結果表明，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，人參皂苷Rb1抑制總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇的升高和高密度脂蛋白膽固醇的降低，緩解STZ誘導的糖尿病大鼠脂質代謝異常。

JNK信號通路可調節(jié)炎癥反應，細胞凋亡及蛋白表達等多種生理學進程，JNK信號通路的失調與神經退行性疾病、糖尿病、自身免疫疾病、癌癥、心臟肥大及哮喘等多種疾病相關[23]。許多植物提取物可通過JNK信號通路發(fā)揮其生物學功能。Yu等[24]發(fā)現(xiàn)葛花提取物可通過JNK信號通路抑制STZ誘導的糖尿病大鼠心臟組織心肌細胞凋亡。闊葉山麥冬可通過JNK信號通路改善2型糖尿病大鼠中的糖脂代謝異常[25]。Guan等[26]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Compound K可通過JNK信號通路改善2型糖尿病大鼠的糖脂代謝的異常。有研究表明在卡拉膠誘導的爪子水腫大鼠模型中，人參皂苷Rb可通過JNK信號通路的調節(jié)發(fā)揮抗炎的作用[27]。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re可通過JNK信號通路促進坐骨神經嵌壓性損傷大鼠神經再生。據(jù)報道人參皂苷Rb1可通過JNK信號通路的失活抑制血管緊張素Ⅱ誘導的腹主動脈瘤小鼠主動脈促炎癥因子表達的升高[29]。本文結果顯示，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，人參皂苷Rb1可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠JNK信號通路相關蛋白JNK1和c-Jun表達的升高。

許多疾病都會出現(xiàn)炎癥反應。大量數(shù)據(jù)表明多種植物提取物可改變各類疾病中炎癥因子水平。有研究發(fā)現(xiàn)藏紅花水提取物可抑制糖尿病大鼠TNF-α表達的升高[30]。Patra等[31]研究顯示鳳凰木樹皮提取物可抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達的升高。有數(shù)據(jù)顯示在2型糖尿病大鼠中，水麻葉提取物可抑制腎臟及心臟組織IL-1β、TNF-α和IL-6的表達[32]。Park等[33]發(fā)現(xiàn)蜜柚皮的提取物可抑制炎癥因子IL-6、TNF-α的表達的升高。有研究表明黑人參提取物具有抗糖尿病的作用，可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠胰腺炎癥因子IL-1β、TNF-α表達[34]。Zhu等[35]研究表明人參皂苷Rg1可降低結腸炎小鼠樹突細胞IL-1β和TNF-α水平的升高，從而降低炎癥反應。有數(shù)據(jù)顯示，在肺損傷大鼠中人參皂苷Rg3可抑制肺組織TNF-α水平的升高[36]。據(jù)報道人參皂苷Rg3可降低切痛大鼠炎癥因子IL-1β和IL-6水平起到鎮(zhèn)痛的作用[37]。Ma等[38]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb3可抑制缺血再灌注損傷引起的心肌細胞炎癥因子TNF-α和IL-6表達的升高。有數(shù)據(jù)表明人參皂苷Rg1可抑制STZ誘導的糖尿病大鼠IL-6、TNF-α表達的升高[39]。本文結果顯示，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，人參皂苷Rb1減弱STZ誘導的糖尿病大鼠炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達，抑制肝臟炎癥反應。

本研究表明，在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，人參皂苷Rb1可改善STZ誘導的糖尿病大鼠肝損傷。抑制血糖的升高和胰島素及C肽濃度的降低。緩解總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇的升高和高密度脂蛋白膽固醇的降低。抑制鼠JNK信號通路相關蛋白JNK1和c-Jun及炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達的升高。綜上所述，人參皂苷Rb1可通過抑制JNK信號通路改善糖尿病大鼠肝損傷及糖脂代謝異常，降低炎癥反應。由于糖尿病常伴有多種并發(fā)癥，下一步計劃研究人參皂苷Rb1對糖尿病引發(fā)的腎病、中風及神經性疾病等并發(fā)癥的影響，為糖尿病新藥開發(fā)奠定基礎。

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