固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中克倫特羅殘留量及條件優(yōu)化

(鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鎮(zhèn)江 212132)

克倫特羅(Clenbuterol)既不是獸藥，也不屬于添加劑，而是一種激素類物質(zhì)，俗稱“瘦肉精”，該物質(zhì)能促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)脂肪分解代謝，增加蛋白質(zhì)合成，提高瘦肉率，然而人體食用高殘留量的內(nèi)臟組織或者累計(jì)攝入量超過(guò)一定值時(shí)便可能引發(fā)食物中毒事件[1-3]。1997 年我國(guó)明令禁止在畜牧行業(yè)生產(chǎn)、銷售和使用克倫特羅，但是非法使用克倫特羅的事件仍時(shí)有發(fā)生[4]。

現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定克倫特羅的方法有酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法、液相色譜法和質(zhì)譜法[5-8]，針對(duì)不同的樣品基質(zhì)和實(shí)驗(yàn)室條件可以選擇合適的測(cè)定方法。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22944—2008中采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中克倫特羅的殘留量[9]，該方法對(duì)儀器條件要求較高，而關(guān)于高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中克倫特羅的文獻(xiàn)并不多見(jiàn)，于是嘗試建立固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中克倫特羅的方法并對(duì)測(cè)試條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器和試劑

Waters e2695液相色譜儀(主要包括2998光電二極管矩陣檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，自動(dòng)脫氣四元梯度泵等，美國(guó)Waters公司)；微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；12位固相萃取真空裝置(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；12位干浴氮吹儀(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)； Millpore超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millpore公司)。

甲醇中鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液(250μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；甲醇、乙酸乙酯和乙酸為色譜純(美國(guó)Tedia公司)；無(wú)水乙醇、鹽酸、乙酸鈉、乙酸銨、磷酸二氫鈉、氨水和磷酸為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Millpore超純水系統(tǒng)制得，18MΩ·cm，25 ℃；CNWBOND WCX(500mg，6mL)、CNWBOND SCX(500mg，6mL)、CNW Poly-Sery MCX(60mg，3mL)和CNW Poly-Sery HLB(500mg，6mL) 固相萃取柱(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；Oasis MCX(60mg，3mL)和Oasis HLB(200mg，6mL)固相萃取柱(美國(guó)Waters公司)。

1.2 色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18-WP (250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇：磷酸二氫鈉(0.02mol/L)=40∶60；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。

1.3 樣品前處理

稱取約2g蜂蜜樣品于50mL離心管中，加入20mL乙酸鈉緩沖溶液(0.2mol/L，pH=5.0)，漩渦混勻，蜂蜜完全溶解后備用，待凈化。

采用不同填料的固相萃取柱進(jìn)行凈化，固相萃取柱填料不同，活化和凈化方法也有所區(qū)別，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

(1)WCX固相萃取柱

依次用5mL乙醇和5mL水活化固相萃取柱，將上述蜂蜜提取液全部轉(zhuǎn)移至活化后的固相萃取柱中，分別用5mL水和5mL 乙醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-乙醇溶液(體積比2∶98)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1mL水溶解殘?jiān)^(guò)0.22μm濾膜后進(jìn)樣測(cè)定。

(2)SCX固相萃取柱

依次用5mL甲醇、5mL水和5mL 0.03mol/L鹽酸溶液活化固相萃取柱，將上述蜂蜜提取液全部轉(zhuǎn)移至活化后的固相萃取柱中，分別用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液(體積比5∶95)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1mL水溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22μm濾膜后進(jìn)樣測(cè)定。

(3)MCX固相萃取柱

依次用3mL甲醇、3mL水和3mL 0.1mol/L鹽酸溶液活化固相萃取柱，將上述蜂蜜提取液全部轉(zhuǎn)移至活化后的固相萃取柱中，分別用3mL 0.1mol/L鹽酸溶液、3mL水和3mL50%甲醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，真空抽干2min，最后用5mL氨水-甲醇-乙酸乙酯溶液(體積比5∶45∶50)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1mL水溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22μm濾膜后進(jìn)樣測(cè)定。

(4)HLB固相萃取柱

依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，將上述蜂蜜提取液全部轉(zhuǎn)移至活化后的固相萃取柱中，分別用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液(體積比5∶95)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)^(guò)0.22μm濾膜后進(jìn)樣測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

采用Waters 2998二級(jí)管陣列檢測(cè)器的3D掃描功能，在波長(zhǎng)190～400nm范圍內(nèi)對(duì)高濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，并在克倫特羅出峰位置提取光譜圖，見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，克倫特羅的最大吸收波長(zhǎng)在210nm附近，因此選擇210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，此時(shí)克倫特羅的響應(yīng)值最大。

2.2 流動(dòng)相對(duì)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定的影響

以甲醇-水、甲醇-乙酸鹽和甲醇-磷酸鹽為流動(dòng)相，從pH值、流動(dòng)相比例和方法重復(fù)性3個(gè)方面考察流動(dòng)相對(duì)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖中并沒(méi)有明顯的克倫特羅色譜峰，當(dāng)流動(dòng)相中加入磷酸后克倫特羅開(kāi)始出峰；隨著磷酸加入量的增加，其保留時(shí)間提前并且峰高與峰面積也隨著增加；當(dāng)進(jìn)一步提高流動(dòng)相中磷酸含量時(shí)，克倫特羅的保留時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，但是峰面積保持不變。這是由于克倫特羅呈弱酸性，在水溶液中以離子形態(tài)存在，降低了在C18色譜柱上的保留行為，而磷酸的加入能夠抑制克倫特羅的電離，使其以分子的形態(tài)存在，增加克倫特羅在C18色譜柱上的保留，并改善峰形。以甲醇-乙酸鹽和甲醇-磷酸鹽為流動(dòng)相時(shí)，克倫特羅的電離得到抑制，峰形較好，pH值對(duì)保留時(shí)間和峰面積的影響也較小。

圖1 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的3D掃描圖(a)和吸收光譜圖(b)

采用上述3種流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定時(shí)，改變流動(dòng)相中甲醇含量對(duì)克倫特羅的保留時(shí)間和峰形具有很大的影響。隨著流動(dòng)相中甲醇含量的減少，克倫特羅的保留時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，峰寬變寬，峰高變小，方法的靈敏度變低。以甲醇-水流動(dòng)相為例，當(dāng)流動(dòng)相pH=2.8，甲醇含量為20%時(shí)，克倫特羅的保留時(shí)間為17min左右；甲醇含量為45%時(shí)，克倫特羅的保留時(shí)間提前到3min左右，而且與溶劑峰重疊，不利于定性和定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 流動(dòng)相比例對(duì)克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定的影響流動(dòng)相中甲醇含量分別為(a).20%;(b).25%;(c).30%;(d).35%;(e).40%;(f).45%

采用Waters e2695液相色譜儀的自動(dòng)進(jìn)樣器，吸取一定濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，連續(xù)6針進(jìn)樣，在上述3種流動(dòng)相條件下進(jìn)行測(cè)試，考察方法的重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇-水流動(dòng)相條件下，當(dāng)流動(dòng)相pH=2.8，甲醇含量為30%時(shí)，克倫特羅的保留時(shí)間不穩(wěn)定，隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加，保留時(shí)間不斷前移，6針進(jìn)樣后克倫特羅保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為1.3%。甲醇含量增加至40%時(shí)，雖然能夠提高方法的重復(fù)性，但是保留時(shí)間較短，容易受到樣品中雜質(zhì)組分的干擾。甲醇-乙酸鹽和甲醇-磷酸鹽流動(dòng)相條件下克倫特羅的保留時(shí)間穩(wěn)定，連續(xù)6針進(jìn)樣，克倫特羅保留時(shí)間的RSD值分別為0.1%和0.3%。

2.3 流動(dòng)相對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量測(cè)定的影響

蜂蜜及蜂蜜加標(biāo)樣品，經(jīng)過(guò)固相萃取柱富集、凈化、濃縮后，分別采用上述3種流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，考察流動(dòng)相對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量測(cè)定結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇-水為流動(dòng)相，當(dāng)流動(dòng)相pH=2.8，甲醇含量為40%時(shí)，蜂蜜樣品提取后直接進(jìn)樣測(cè)定色譜圖中，在克倫特羅保留時(shí)間處有一個(gè)很大的雜質(zhì)峰，雖然該雜質(zhì)峰經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后消失，但是實(shí)際檢測(cè)時(shí)該雜質(zhì)峰對(duì)克倫特羅測(cè)定仍然存在隱患，如果凈化不干凈，就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，同時(shí)，在該流動(dòng)相條件下，樣品在2～6min內(nèi)有許多雜質(zhì)峰，影響克倫特羅與雜質(zhì)組分之間的分離度。當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-乙酸鹽時(shí)，克倫特羅的測(cè)定受到雜質(zhì)組分的影響很大，克倫特羅出峰時(shí)基線較高，而且與雜質(zhì)組分不能基線分離；降低流動(dòng)相中甲醇含量，樣品中克倫特羅的靈敏度明顯降低。當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-磷酸鹽時(shí)，克倫特羅與樣品中的雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)基線分離，其保留時(shí)間附近的干擾組分較少，靈敏度能夠滿足殘留量檢測(cè)的要求。同時(shí)，在此色譜條件下，蜂蜜加標(biāo)樣品只需經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的提取便能直接測(cè)定，給高殘留值蜂蜜樣品的測(cè)定提供了便捷的方法。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)，最終選擇采用甲醇-磷酸鹽為流動(dòng)相對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量進(jìn)行測(cè)定。

圖3流動(dòng)相對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量測(cè)定的影響(a).甲醇-水;(b).甲醇-乙酸鹽;(c).甲醇-磷酸鹽

2.4 固相萃取柱對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量測(cè)定的影響

以甲醇-磷酸鹽為流動(dòng)相，測(cè)定固相萃取柱凈化后的蜂蜜加標(biāo)樣品，考察固相萃取柱對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量測(cè)定的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4中可以看出，CNWBOND SCX固相萃取柱凈化后雜質(zhì)組分的響應(yīng)值依然很大，SN/T 1924-2007中采用了C18和SCX固相萃取柱串聯(lián)的方法進(jìn)行凈化[10]，而本實(shí)驗(yàn)僅采用了SCX固相萃取柱進(jìn)行凈化，這可能是導(dǎo)致雜質(zhì)去除不完全的原因之一；采用其他幾種固相萃取柱凈化后，色譜圖中雜質(zhì)峰的響應(yīng)值明顯降低，其中采用WCX固相萃取柱凈化后的色譜圖中雜質(zhì)少，基線比較平整。對(duì)比相同填料不同品牌固相萃取柱凈化后的色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，兩種品牌的固相萃取柱對(duì)雜質(zhì)去除能力難分伯仲。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取1.0mL鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL容量瓶中，用水稀釋成濃度為10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。吸取適量體積克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水稀釋配成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并按上述選定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以樣品峰面積Y(mV)對(duì)質(zhì)量濃度X(μg/mL)作圖，得到線性回歸方程Y=146893X+311，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，結(jié)果表明：克倫特羅含量在0.10～1.00μg/mL之間時(shí)，該方法呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖4固相萃取柱對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量測(cè)定的影響(a).CNWBOND WCX;(b).CNWBOND SCX;(c).CNW Poly-Sery MCX;(d).CNW Poly-Sery HLB;(e).Oasis MCX;(f).Oasis HLB

2.6 回收率及固相萃取柱性能測(cè)定

稱取約2g蜂蜜樣品，共12份，往每份樣品中加入0.50mL濃度為1.0μg/mL的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，樣品經(jīng)乙酸鈉緩沖溶液提取后，分別采用上述6種固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，每種固相萃取柱做2平行，并以甲醇-磷酸鹽為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，考察固相萃取柱的回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)定結(jié)果表明，6種固相萃取柱均具有較好的回收率，回收率大于85%，其中MCX和HLB固相萃取柱的回收率明顯高于其他兩種填料的固相萃取柱；實(shí)驗(yàn)中所使用的相同填料不同品牌的固相萃取柱回收率結(jié)果相近。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果 %

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)建立了固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中克倫特羅的方法，分別以甲醇-水、甲醇-乙酸鹽和甲醇-磷酸鹽為流動(dòng)相，考察了流動(dòng)相對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，流動(dòng)相對(duì)pH值的緩沖能力較弱，克倫特羅的保留時(shí)間發(fā)生漂移；以甲醇-乙酸鹽為流動(dòng)相時(shí)，基線噪音較大，方法靈敏度低；以甲醇-磷酸鹽為流動(dòng)相時(shí)，方法重復(fù)性好，靈敏度較高。

(2)實(shí)驗(yàn)中考察了固相萃取柱填料和品牌對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固相萃取柱對(duì)蜂蜜中克倫特羅殘留量的測(cè)定結(jié)果有很大的影響，4種不同填料的固相萃取柱中，MCX和HLB固相萃取柱的回收率較高，WCX和SCX固相萃取柱的回收率略低，相同填料不同品牌的固相萃取柱回收率結(jié)果相近。

[1]侯仕農(nóng),閆強(qiáng),馬愛(ài)民.鹽酸克倫特羅的藥理作用對(duì)食品安全的危害和檢測(cè)技術(shù)[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2006(6):29-31.

[2]楊浩峰,嚴(yán)蕾.鹽酸克倫特羅的藥理作用危害及檢測(cè)[J].地方病通報(bào),2006(1):101-104.

[3]張華.瘦肉精的危害及檢測(cè)方法[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(1):83- 84.

[4]陳肇臻,劉小剛.豬肝中克倫特羅的測(cè)定─反相高效液相色譜法[J].質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督研究,2014,1(31):14-27.

[5]安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.DB34/T 823-2008 動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅的殘留測(cè)定—酶聯(lián)免疫吸附法[S].

[6]安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.DB34/T 818—2008飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定—膠體金免疫層析法[S].

[7]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1924-2011進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011.

[8]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部與中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.192-2003. 動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[9]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局與中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 22944-2008蜂蜜中克倫特羅殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009.

[10]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1924-2007進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.