1-氯-3-丁烯-2-酮與N-乙酰半胱氨酸的反應(yīng)

劉柏良,張新宇

(上海大學環(huán)境與化學工程學院,上海200444)

1,3-丁二烯(l,3-butadiene,BD)是一種產(chǎn)量較大的石油化工產(chǎn)品,常溫下為無色且略有芳香氣味的氣體,主要用于制造合成橡膠、樹脂和塑料.BD在大氣中廣泛存在,主要來自化石燃料和生物質(zhì)的不完全燃燒,如汽車尾氣和香煙煙霧等[1].

BD是具有高致癌風險的大氣有機污染物之一[2].根據(jù)美國國家環(huán)境保護局的數(shù)據(jù),當BD質(zhì)量濃度為0.3μg/m3時就可達到10?5致癌風險水平[3],低于同樣風險水平下苯的質(zhì)量濃度(1.3～4.5μg/m3)[4].BD被認為是香煙煙霧中致癌性最強的物質(zhì)[5],甚至在二手煙和三手煙中也是非常有害的揮發(fā)性有機化合物之一[6].流行病學研究已經(jīng)建立了人體BD暴露與淋巴-造血系統(tǒng)癌癥發(fā)病率升高之間的因果關(guān)聯(lián)[1].

BD不是直接致癌物,其致癌效應(yīng)源于代謝產(chǎn)物.BD有兩條代謝途徑:一是被細胞色素P450酶代謝生成具有致突變性和致癌性的3種環(huán)氧化物——3,4-環(huán)氧-1-丁烯,3,4-環(huán)氧-1,2-丁二醇和雙環(huán)氧丁烷[7];二是在H2O2和高濃度Cl?(＞50 mmol/L)存在的情況下被髓過氧化酶 (myeloperoxidase,MPO)代謝為 1-氯-2-羥基-3-丁烯 (1-chloro-2-hydroxy-butene,CHB)(見圖1)[8].前一條代謝途徑主要存在于肝臟、肺臟和腎臟等器官中,而后一條途徑僅能存在于骨髓細胞和血液的中性粒細胞中,因為只有這些細胞中存在MPO.由于BD會引起人體造血系統(tǒng)癌癥[1],而造血系統(tǒng)位于骨髓,因此后一條途徑可能與BD對人體的致癌性有密切關(guān)聯(lián).

圖1 BD代謝為CHB和CBO的途徑以及CBO與GSH的反應(yīng)Fig.1 Metabolism of BD to form CHB and CBO,and the reaction of CBO with GSH

CHB可被乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)進一步轉(zhuǎn)化為1-氯-3-丁烯-2-酮(1-chloro-3-buten-2-one,CBO)(見圖1)[9].CBO是一種較強的Michael受體,容易與親核試劑發(fā)生反應(yīng),如與核苷反應(yīng)產(chǎn)生多種加成產(chǎn)物[10-12],而且被證明有較強的細胞毒性和遺傳毒性[13].CBO與谷胱甘肽(glutathione,GSH)迅速反應(yīng)會產(chǎn)生3種偶聯(lián)產(chǎn)物,包括CBO雙鍵端和氯甲基端分別與GSH巰基反應(yīng)產(chǎn)生的兩種單偶聯(lián)產(chǎn)物和CBO兩端均與GSH反應(yīng)產(chǎn)生的雙偶聯(lián)產(chǎn)物(見圖1)[9].

預計一旦CBO在體內(nèi)形成,會迅速被細胞內(nèi)GSH捕獲產(chǎn)生GSH偶聯(lián)產(chǎn)物.這些產(chǎn)物隨血液循環(huán)到達腎臟,在腎臟內(nèi)被代謝產(chǎn)生CBO與N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)的偶聯(lián)產(chǎn)物,最終隨尿排出體外.因此,CBO與NAC的偶聯(lián)產(chǎn)物可以作為CBO形成的生物標志物.然而,CBO與NAC的反應(yīng)尚未見報道.因此,本工作研究了CBO與NAC在體外生理條件(pH=7.4,37?C)下的反應(yīng)并確定了產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu).

1 材料與儀器

1.1 實驗材料與試劑

NAC、重水和氘代二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購于Sigma-Aldrich公司,高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)等級甲醇、三氟乙酸(trif l uoroacetic acid,TFA)以及其他試劑購于國藥集團化學試劑有限公司,CBO按照文獻[9]的方法合成,純度為80%.

1.2 儀器

Waters Alliance 2695 HPLC系統(tǒng),配置Waters 2475多通道熒光檢測器.色譜柱:Agilent ZORBAX 80?A StableBond SB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5μm)及Waters SunFire Prep C18制備柱(10 mm×150 mm,5μm).Bruker Instruments Avance AV500核磁共振(nuclear magnetic resonance,NNR)光譜儀(500 MHz).

1.3 高效液相色譜方法

HPLC流動相:A相為1%甲醇,B相為30%甲醇,均使用三氟乙酸(trif l uoroacetic acid,TFA)調(diào)節(jié)pH 值至2.5.分析時使用的梯度如下:1 min時由0%B相用6 min升至93%,7 min時用1 min升至100%,17 min時用1 min降至0%,停止于18 min(流速1 mL/min);制備時使用80%B相等度洗脫14 min(流速3 mL/min).

2 實驗方法

2.1 NAC與CBO(摩爾比3∶1)的反應(yīng)

11.4 mg(70μmol)NAC溶于4 mL pH=7.4的磷酸緩沖液(100 mmol/L KH2PO4,150 mmol/L KCl,1.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA))中.取2.9 mL溶液,加入2μL CBO(17μmol),立即取樣檢測.37?C下孵育30 min后再次取樣檢測.

2.2 NAC與CBO(摩爾比1∶2)的反應(yīng)

2.3 mg(14μmol)NAC溶于1.2 mL pH=7.4的磷酸緩沖液中.取715μL溶液,加入2μL CBO(17μmol),立即取樣檢測.37?C下孵育30 min后再次取樣檢測.

2.3 NC1和NC2的制備及結(jié)構(gòu)鑒定

制備兩份6.5 mg(40μmol)NAC溶于1.6 mL pH=7.4的磷酸緩沖液中的溶液.分別加入1.5和9.3μL CBO(13和81μmol),37?C下孵育30 min,HPLC分離純化,冷凍干燥分別得到3.2和5.5 mg產(chǎn)物(NC1和NC2),產(chǎn)率分別為63%和51%.產(chǎn)物溶于氘代DMSO或重水進行核磁檢測.

3 結(jié)果與討論

3.1NAC與CBO的反應(yīng)

HPLC分析表明,在NAC∶CBO(摩爾比)=3∶1的情況下,CBO與NAC一經(jīng)混合(即0 min的樣品)即發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生兩種產(chǎn)物,以NC1和NC2表示,保留時間分別為12.3和13.2 min,但反應(yīng)30 min后NC2消失,而NC1增加(見圖2(a)). 在NAC∶CBO=1∶2(摩爾比)的情況下,只有NC2產(chǎn)生(見圖2(b)),且0和30 min時的色譜圖沒有明顯變化.這些實驗結(jié)果表明:CBO與NAC的反應(yīng)速度非?？?當NAC過量時,首先形成兩種產(chǎn)物,但最終只產(chǎn)生NC1;而當CBO過量時則只產(chǎn)生NC2.根據(jù)CBO與GSH的反應(yīng)類推(見圖1),預計NC1是CBO與兩分子NAC形成的偶聯(lián)產(chǎn)物(即雙偶聯(lián)產(chǎn)物),而NC2則是CBO與一分子NAC的偶聯(lián)產(chǎn)物(單偶聯(lián)產(chǎn)物).

圖2 NAC與CBO反應(yīng)混合物的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the reaction mixtures of NAC and CBO

3.2 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

預計NC2是一種單偶聯(lián)產(chǎn)物,光譜較為簡單,故先分析其NMR圖譜(見圖3).圖中,以2.50處的溶劑峰作為內(nèi)標,為清楚顯示較高場(1.5～5.0)處的信號,低場處的兩個質(zhì)子信號12.83(很寬的單峰,1H)和8.24(雙峰,1H,J=8 Hz)未顯示.首先,根據(jù)CBO與GSH的反應(yīng)情況類推(見圖1),CBO與NAC的反應(yīng)可能相似地產(chǎn)生兩種單偶聯(lián)產(chǎn)物,即CBO雙鍵端和氯甲基端分別與NAC反應(yīng)的產(chǎn)物.如果氯甲基端反應(yīng),則產(chǎn)物中存在雙鍵,其質(zhì)子的信號應(yīng)該出現(xiàn)在5～6范圍內(nèi).由于NC2的氫譜中在5～8的范圍內(nèi)沒有任何峰,說明NC2是CBO雙鍵端與NAC發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物.

圖3 NC2在氘代DMSO中的1H NMR圖譜Fig.31H NMR spectrum of NC2 in DMSO-d6

由圖3可見,NC2在氘代DMSO中的氫譜共有14個質(zhì)子,與預計的單偶聯(lián)產(chǎn)物相符.低場處(12.83和8.24,圖3中未顯示)有兩個質(zhì)子的信號,12.83處是一個很寬的單峰,顯然只能是羧基質(zhì)子;而8.24處的峰只能是氮原子上的氫,因為該化合物中沒有芳香環(huán).其他質(zhì)子的信號在1.5～5.0范圍內(nèi)(見圖3),4.52處含2個氫的單峰應(yīng)該是氯甲基質(zhì)子(H-1,見圖4)的信號,因為其不與其他質(zhì)子偶合;4.37處只含1個質(zhì)子的多重峰因其化學位移較高,應(yīng)該是6位的次甲基質(zhì)子;1.85處含3個氫的單峰顯然是甲基質(zhì)子(即H-9);余下的3個亞甲基共6個質(zhì)子,化學位移從2.68～2.91,由于其存在偶合且化學位移相差不大,僅靠一維氫譜確定峰的歸屬有一定困難,因此收集了NC2的二維1H-1H相關(guān)光譜(correlation spectroscopy,COSY)(見圖5)以及二維1H-13C異核多量子相干(heteronuclear multiple quantum coherence,HMQC)圖譜(見圖6).COSY圖譜顯示8.24處的質(zhì)子(NH質(zhì)子)與4.37處的質(zhì)子(H-6)偶合,這與上述通過一維氫譜確定的歸屬相符.進一步地,COSY圖譜表明4.37處的H-6與2.89(四重峰,1H)和2.73(四重峰,1H)處的質(zhì)子偶合,因此2.89和2.73處的峰是5位亞甲基的兩個質(zhì)子的信號.這樣,余下的在2.80和2.70處的兩組峰(每組含2個質(zhì)子,均為三重峰)顯然就是3位和4位的兩個亞甲基的信號.HMQC圖譜表明,2.80和2.70處質(zhì)子對應(yīng)的13C化學位移分別為39.2和25.2處.考慮到羰基吸電子能力大大強于硫原子,故2.80處的峰應(yīng)該是3位亞甲基的質(zhì)子信號,而2.70處的峰則是4位亞甲基信號.至此,NC2的NMR圖譜被完全解析,且光譜數(shù)據(jù)與預計結(jié)構(gòu)(見圖4)完全吻合.

圖4 兩種CBO-NAC偶聯(lián)產(chǎn)物NC1和NC2的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of the two CBO-NAC conjugates(NC1 and NC2)

NC1在重水中的1H NMR圖譜(見圖7)共顯示了18個質(zhì)子,與預計的雙偶聯(lián)產(chǎn)物相符.顯然,4.56～4.62處含2個氫的八重峰是2個次甲基(H-6和H-11)的信號,3.56處的單峰(含2個氫)是1位亞甲基的信號,2.06處的單峰(含6個氫)是2個甲基(H-9和H-14)的信號.余下的4個亞甲基共8個質(zhì)子的信號作為密集的多重峰出現(xiàn)在2.82～3.13范圍內(nèi).NC1的COSY圖譜(見圖8)表明,2.83處的峰(含2個氫,三重峰)與3.01處的峰(含2個氫)偶合,但不與4.56～4.62處的質(zhì)子偶合;再以NC2的數(shù)據(jù)作為參照,確定這兩組峰分別是4位和3位的亞甲基的信號.對于2.88～3.13處的峰,除了3位亞甲基的信號外,尚有4個質(zhì)子的信號,它們都與4.56～4.62處的質(zhì)子偶合,故為5位和10位的兩個亞甲基.這樣,NC1的NMR圖譜被完全解析,且光譜數(shù)據(jù)符合預計結(jié)構(gòu),證明NC1是CBO與NAC的雙偶聯(lián)產(chǎn)物(見圖4).

需要指出的是,NC1是一種新化合物;NC2雖然不是新化合物,但僅僅只有兩篇文獻報道過,且文獻中完全沒有給出任何結(jié)構(gòu)確證信息[14-15].因此,本工作首次用NMR清楚地確定了CBO與NAC的兩種偶聯(lián)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu).

圖5 NC2在氘代DMSO中的二維COSY圖譜(化學位移未校正)Fig.5 2D COSY spectrum of NC2 in DMSO-d6(the chemical shifts are uncorrected)

圖6 NC2在氘代DMSO中的二維HMQC圖譜(化學位移未校正)Fig.6 2D HMQC spectrum of NC2 in DMSO-d6(the chemical shifts are uncorrected)

CBO與GSH反應(yīng)產(chǎn)生兩種單偶聯(lián)產(chǎn)物(見圖1)[9],因此預計CBO與NAC反應(yīng)也可形成兩種單偶聯(lián)產(chǎn)物.但本實驗只產(chǎn)生一種偶聯(lián)產(chǎn)物,可能是因為NAC與GSH的反應(yīng)性有差異的緣故.

圖7 NC1在重水中的1H NMR圖譜(DSS內(nèi)標)Fig.71H NMR spectrum of NC1 in D2O with DSS as the internal standard

圖8 NC1在重水中的COSY圖譜(化學位移未校正)Fig.8 COSY spectrum of NC1 in D2O(the chemical shifts are uncorrected)

4 結(jié)束語

BD是一種幾乎無處不在的空氣污染物,因而研究其致癌機理具有很重要的現(xiàn)實意義.目前針對BD通過MPO的代謝研究還較少,但由于這條途徑與BD對人體的致癌性存在可能的關(guān)聯(lián),因此特別值得深入研究.不過這條途徑上的代謝產(chǎn)物CHB和CBO都僅僅只在體外實驗中得到證實,因此需要研究CHB和CBO在暴露于BD的活體內(nèi)是否能夠產(chǎn)生.因為CBO反應(yīng)性很強,不可能在活體內(nèi)直接被檢測到,只能通過檢查CBO與生物分子如GSH、蛋白質(zhì)和DNA等的反應(yīng)產(chǎn)物而間接地推測其存在.因此,本工作識別的兩種CBO-NAC偶聯(lián)產(chǎn)物可以作為標樣來檢測CBO是否能夠在活體內(nèi)產(chǎn)生,為后續(xù)研究打好了基礎(chǔ).

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