60Co誘變大豆滯綠突變體M6變異分析

溫宏偉，王 鵬，李貴全

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

在植物衰老的過程中，葉片葉綠素降解，出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，植株的生物產(chǎn)量減少。有些植株在生育末期葉片衰老過程中，葉綠素不降解或降解不明顯，葉片和果實(shí)保持綠色，這種現(xiàn)象稱為滯綠（stay-green）現(xiàn)象[1]。豆科植物中普遍存在滯綠現(xiàn)象[2]，如菜豆[3]、豌豆[4]等突變體，滯綠突變體是研究葉綠素代謝、植物衰老進(jìn)程等過程的理想材料。在大豆滯綠突變體中，存在2個隱性滯綠基因，分別為子葉滯綠基因D1和種皮滯綠基因D2，其中，D1被定位在大豆第1條染色體上；D2基因被定位在第11條染色體上[5]，Gm SGR1和Gm SGR2基因分別負(fù)責(zé)大豆子葉和種皮滯綠[6]。

大豆種皮色及大豆子葉色會影響大豆的外觀，而大豆外觀與其商品質(zhì)量存在著密切關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致種皮顏色差異的自然產(chǎn)物包括類黃酮和花青素[7]，對抗氧化性的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生一定的影響，因此，種皮色是一個育種后代評估的重要形態(tài)標(biāo)記，有 5 個位點(diǎn)（I，T，W1，R，O）參與控制其性狀的形成[8]。

不同株系、不同品種農(nóng)藝性狀差異較大[9-10]，滯綠突變體外在表型特殊具有一定的研究價(jià)值。本試驗(yàn)利用60Co-γ射線輻射處理Z-94320（雙青豆）大豆風(fēng)干種子，在M6獲得108個突變系，對其中的40個突變系從農(nóng)藝性狀、生物學(xué)性狀、衰老時期葉片葉綠素含量及蛋白質(zhì)方面進(jìn)行分析，旨在為大豆滯綠突變體的利用及種皮顏色的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2012年，采用60Co-γ射線輻射處理滯綠突變體Z-94320（雙青豆）大豆風(fēng)干種子，劑量率為1.6 Gy/min，種植收獲得到M1，2013年種植得到M2，在M2中選擇優(yōu)良變異單株以及特殊變異個體，經(jīng)過幾年的連續(xù)選育，到2017年獲得M6，共108個突變體品系。

1.2 試驗(yàn)方法

2016年5月9日在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆育種試驗(yàn)田播種M5種子，收獲M6突變體108種材料，行長5 m，行距0.5 m，株距0.25 m，重復(fù)3次，常規(guī)田間管理，生育期調(diào)查記錄主要生物性狀，利用SPAD-502葉綠素測定儀測定葉片葉綠素含量。成熟后，每株系隨機(jī)抽取5株進(jìn)行農(nóng)藝性狀室內(nèi)考種，測產(chǎn)。測定的農(nóng)藝性狀主要有株高、株質(zhì)量、結(jié)莢高度、莖粗、主莖節(jié)數(shù)、有效分枝、主莖莢數(shù)、分枝莢數(shù)、1粒莢數(shù)、2粒莢數(shù)、3粒莢數(shù)、4粒莢數(shù)、癟粒莢數(shù)、總莢數(shù)、蟲食數(shù)、百粒質(zhì)量以及單株粒質(zhì)量[11]。用InfratecTM 1241 Grain Analyzer V5.00品質(zhì)分析儀對大豆的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測量。對照為滯綠突變體 Z-94320（雙青豆）（CK）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS19.0，Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滯綠突變體后代主要生物學(xué)性狀的變異分析

對M6突變系中的108個株系的17個農(nóng)藝性狀進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示。由表1可知，M6突變系中在株質(zhì)量、株高、莖粗、主莖節(jié)數(shù)、2粒莢數(shù)、3粒莢數(shù)、總莢數(shù)、單株粒質(zhì)量這8個農(nóng)藝性狀方面的均值和CK相比，變化較大。M6突變系中各農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)從大到小分別為：4粒莢數(shù)（115.04%），分枝莢數(shù)（87.93%），癟粒莢數(shù)（71.59%），蟲食數(shù)（65.45%），3粒莢數(shù)（64.41%），有效分枝（52.22%），1粒莢數(shù)（49.51%），2粒莢數(shù)（48.04%），結(jié)莢高度（45.42%），單株粒質(zhì)量（44.30%），株質(zhì)量（43.60%），總莢數(shù)（39.68%），主莖莢數(shù)（27.92%），百粒質(zhì)量（8.02%）。結(jié)果表明，在M6突變系中可以著重從4粒莢數(shù)、分枝莢數(shù)、3粒莢數(shù)以及結(jié)莢高度和單株粒質(zhì)量這幾個具有潛力的農(nóng)藝性狀中選擇適合選育目標(biāo)的材料。

表1 突變體M6農(nóng)藝性狀及蛋白質(zhì)均值和變異系數(shù)

從圖1可以看出，大豆滯綠突變體誘變后代中，相對于對照的種皮，誘變后代中出現(xiàn)了種皮色的變異（A2），種皮顏色為綠到黃以及中間的過渡色（A1，A2），在M6的 108個突變系中，按種皮色分類可將其分為 4 類（I，II，III，IV），以 12 號為代表的突變系I中，種皮色為綠色，子葉色為綠色；62號代表的突變系II中，種皮色為淺綠色，子葉色為綠色；104號和74號代表的突變系III中，種皮色為淺綠色，子葉色為黃色；96號和106號代表的突變系IV中，種皮色為黃色，子葉色為黃色，而對照株系種皮色和子葉色均為綠色。M6突變系中豆莢色發(fā)生變異（A4），出現(xiàn)黃褐色（95）、淺褐色（98）、褐色（90）、深褐色（19）4種。在M6突變系中出現(xiàn)分枝數(shù)增多、莖稈變粗的株系（A5），16號材料可作為突變系中重點(diǎn)關(guān)注的材料。

2.2 滯綠突變體后代葉片葉綠素含量比較

從M6突變系中選出40個突變系，按種皮色和子葉色分為 4 類（I，II，III，IV），每一類 10 個株系。

從圖2，3可以看出，種皮色和子葉色均為綠色的CK和M6突變系在苗期和盛花期葉綠素含量變化不大，大部分材料在衰老期葉綠素含量相對于盛花期呈現(xiàn)上升的趨勢。在II類突變系中，苗期到盛花期間葉綠素含量變化不大，在盛花期到衰老期大部分突變系葉綠素含量保持不變，少數(shù)突變系葉綠素含量呈上升趨勢。

從圖4可以看出，在III類突變系中，在苗期到盛花期間不同株系的葉綠素含量有升有降，其中，28，65號突變系在這個期間呈現(xiàn)上升的趨勢。在盛花期到衰老期間，在衰老的過程中，74號材料的葉綠素含量呈現(xiàn)上升趨勢，其他材料葉綠素含量均呈現(xiàn)下降趨勢。

由圖5可知，在IV類突變系中苗期到盛花期葉綠素含量變化不大，在衰老期葉綠素含量降幅明顯。結(jié)果表明，在大豆植株衰老的過程中，種皮色和子葉色與葉片葉綠素含量有著一定的關(guān)系，種皮色和子葉色均為綠色的突變系中，存在著滯綠現(xiàn)象，種皮色越綠葉片葉綠素含量越高，而黃色的突變系中存在黃化現(xiàn)象，導(dǎo)致衰老期葉片葉綠素下降。種皮色一致的情況下，在大豆衰老期，子葉色為綠色的突變系比黃色的突變系葉片葉綠素含量下降幅度小甚至出現(xiàn)葉綠素含量上升的趨勢。

2.3 滯綠突變體后代蛋白質(zhì)分析

由表1可知，M6的108個突變系中蛋白質(zhì)含量的變幅為40.9%～46.5%，與對照株系的44.3%相比，有增有減，蛋白質(zhì)的變異系數(shù)為2.49%。對M6選出的40個株系的蛋白質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，M6-84的蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到46.5%，其種皮色和子葉色均為綠色；M6-105的蛋白質(zhì)含量最低，為40.9%，其種皮色和子葉色均為黃色。蛋白質(zhì)均值從大到小排序?yàn)椋篒（44.06%）＞II（43.91%）＞III（42.84%）＞IV（42.78%）（表2）。結(jié)果表明，大豆滯綠突變體中，綠色種皮、綠色子葉的大豆蛋白質(zhì)含量相對高于黃色種皮、黃色子葉的大豆突變系，且滯綠大豆的蛋白質(zhì)含量相對較高，均值達(dá)到44%左右。

表2 滯綠突變體M6蛋白質(zhì)含量及其均值 %

3 討論與結(jié)論

利用輻射誘變技術(shù)，育種家已經(jīng)選育出大量的優(yōu)良品種，如水稻脆性突變體[12]等。楊凱敏等[13]對60Co誘變晉大78的M5表型性狀進(jìn)行變異分析，為誘變育種幫助加快選育高產(chǎn)大豆品種提供一定理論依據(jù)。本試驗(yàn)對大豆滯綠突變體M6的農(nóng)藝性狀、生物性狀、衰老期葉片葉綠素、蛋白質(zhì)的變異及變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，108個突變系中，4粒莢數(shù)、分枝莢數(shù)、3粒莢數(shù)及結(jié)莢高度和單株粒質(zhì)量變異潛力大，例如，對照的單株粒質(zhì)量為14.02 g，而誘變后代的突變系中單株粒質(zhì)量變幅為7.45～62.61 g，變異系數(shù)為44.3%，在產(chǎn)量方面具有巨大的潛力，從中可選育出高產(chǎn)突變系。有研究通過對不同百粒質(zhì)量野生大豆的生物學(xué)性狀分析發(fā)現(xiàn)，隨著百粒質(zhì)量的增加，大豆粒色逐漸由以黑色為主到出現(xiàn)了多種顏色，臍色由以黑色為主到有褐色和深褐色[14]。在突變系中，種皮顏色出現(xiàn)了變異，呈現(xiàn)出從綠到黃色的過渡變異，將其分為4種類型：I.種皮色、子葉色均為綠色；II.種皮色為淺綠色，子葉色為綠色；III.種皮色為淺綠色，子葉色為黃色；IV.種皮色和子葉色均為黃色。子葉色出現(xiàn)了黃色變異，可能是控制種皮色和子葉色的基因位點(diǎn)發(fā)生了改變或缺失，有待進(jìn)一步從基因?qū)用嫔线M(jìn)行研究。

滯綠突變體誘變后代滯綠特性有減弱趨勢[15]，通過對突變系葉片葉綠素分析發(fā)現(xiàn)，在大豆衰老期過程中，葉片葉綠素含量變化與種皮色和子葉色有一定的關(guān)系，種皮色越綠，葉片葉綠素含量越高，且不降解，認(rèn)為這類突變系為功能性突變體[16]；而黃色的突變系中，衰老期葉片葉綠素下降。種皮色一致的情況下，在大豆衰老期，子葉色為綠色的突變系比黃色的突變系葉片葉綠素含量下降幅度小甚至出現(xiàn)葉綠素含量上升的趨勢，這可能與衰老期葉綠素降解受阻有關(guān)。輻射誘變對品質(zhì)的改良起到一定作用[17-18]，本研究通過蛋白質(zhì)分析，結(jié)果表明，大豆滯綠突變體中，綠色種皮、綠色子葉的大豆蛋白質(zhì)含量相對高于黃色種皮、黃色子葉的大豆突變系，且滯綠大豆的蛋白質(zhì)含量相對較高，均值達(dá)到44%左右。這與薛樹鵬等[19]對大豆科豐14研究得出的誘變后代蛋白質(zhì)含量降低結(jié)果不一致，可能是由于突變系材料不一致導(dǎo)致的。今后可以在分子基因方面，深入研究種皮色、子葉色與品質(zhì)方面的關(guān)系，以獲得優(yōu)質(zhì)的突變系材料，為育種工作作出新的貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］孫佩光，吳瓊，徐碧玉，等.植物滯綠機(jī)理研究進(jìn)展[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（2）：438-448.

［2］任鈞，王曉磊，高炯，等.國內(nèi)大豆品種資源中滯綠（stay-green）性狀的初步研究[J].植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（9）：1336-1346.

［3］RNNINGCM，BOUWKAMP J C，SOLOMOST.Observations on the senescence of a mutant non-yellowing genotype of Phaseolus vulgaris L.[J].J Exp Bot，1991，42：235-241.

［4］ THOMAS H，SCHELLENBERG M，VICENTINI F，et al.Gregor mendel's green and yellowpea seed[J].Bot Acta，1996，109：3-4.

［5］ FANG C，LI C，LI W，et al.Concerted evolution of D1 and D2 to regu-late chlorophyll degradation in soybean[J].Plant J，2014，77（5）：700-712.

［6］ NAKANO M，YAMADA T，MASUDA Y，et al.A green-cot-yledon/stay-green mutant exemplies the ancient whole-genome duplications in soybean[J].Plant Cell Physiol，2014，55（10）：1763-1771.

［7］ YANG K，JEONG N，MOON J K，et al.Genetic analysis of genes controllingnatural variation ofseed coat and flower colors in soybean[J].J Hered，2010，101（6）：757-768.

［8］宋健，郭勇，邱麗娟.大豆種皮色相關(guān)基因定位[C]//第二屆植物生物技術(shù)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)論壇.武漢：武漢大學(xué)，2013.

［9］白志元，張瑞軍，雷夢林，等.不同株系制種對大豆雜交種農(nóng)藝性狀的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（8）：1055-1058，1072.

［10］郭數(shù)進(jìn)，楊凱敏，霍瑾，等.大豆不同性狀與產(chǎn)量的相關(guān)性及主成分分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（5）：505-508.

［11］王宏勇，郭數(shù)進(jìn)，李貴全.晉旱125×（昔野×501）雜交后代產(chǎn)量與主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性及主成分分析[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，23（3）：76-80.

［12］劉斌美，葉亞峰，章忠貴，等.一個秈稻脆性突變體的生物學(xué)特性及基因定位研究 [J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，12（5）：259-264.

［13］楊凱敏，李貴全，郭數(shù)進(jìn)，等.60Co誘變大豆后代表型性狀的研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，20（10）：5-9.

［14］楊萬明，王敏，張謹(jǐn)華，等.不同百粒質(zhì)量山西野生大豆生物學(xué)性狀比較[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（7）：927-931，937.

［15］周永航.大豆滯綠（Stay-green）突變體在輻射誘變育種中的應(yīng)用研究[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［16］田風(fēng)霞，惠振，王國坤，等.植物體內(nèi)的葉綠素降解與滯綠突變體[J].植物生理學(xué)通訊，2010，46（5）：505-511.

［17］于紹軒，韓粉霞，孫君明，等.空間環(huán)境對大豆主要農(nóng)藝性狀及蛋白品質(zhì)的誘變效應(yīng)[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，24（3）：453-459.

［18］ MANJAYA J G，SUSEELAN K N，GOPALAKRISHNA T，et al.Radiation induced variability of seed storage proteins in soybean（Glycine max （L.）Merrill）[J].Food Chemistry，2007，100（4）：1324-1327.

［19］薛樹鵬，郭蓓，楊柳，等.大豆‘科豐14’誘變系主要農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀變異分析[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2014，4（3）：1-6.