淺談生物種質(zhì)資源保存技術(shù)和方法

王立輝

（西藏自治區(qū)高原生物研究所，西藏 拉薩 850008）

1 植物種子保存技術(shù)

1.1 技術(shù)原理

種子保存采用國(guó)際生物多樣性組織推薦的種子保存方法，即在相對(duì)濕度10-15%和10-20℃的溫度下將種子干燥至水分含量5%左右，然后將種子密封在容器內(nèi)（以保持它們的水分含量），儲(chǔ)藏在-18℃或更低的溫度下［2-3］。

1.2 技術(shù)路線

種子保存的技術(shù)主要步驟包括種子的采集（采集、記錄、標(biāo)本收集等）、前期處理（初步干燥、清除雜物，包括去果皮、果翅、壞空種子等）、干燥、入庫(kù)保存、庫(kù)存種子活力檢測(cè)、復(fù)壯等，并包括所有有關(guān)數(shù)據(jù)的錄入和處理等。

具體步驟：制定采集計(jì)劃/尋求有關(guān)方面的許可、野外采集、迅速運(yùn)送種子回庫(kù)、采集數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)錄入、初步干燥（15%相對(duì)濕度，15℃＞1周）、清理、X-光射線分析、切割試驗(yàn)、種子數(shù)量測(cè)定、主要干燥（10%相對(duì)濕度，18℃＞4周）、封裝/入庫(kù)、初始活力檢測(cè)、種名證實(shí)、送出復(fù)份樣品、種子的分發(fā)、活力復(fù)測(cè)與復(fù)壯（每5年或10年1次）。

2 植物離體保存技術(shù)

2.1 技術(shù)原理

植物離體保存，是植物種子保存的補(bǔ)充，主要保存對(duì)象是種子頑拗型植物、多年生一次性開(kāi)花植物、多漿植物，其它難以用種子保存的植物，以及采用離體保存比用種子保存更經(jīng)濟(jì)有效的植物。例如蘭科、天南星科、棕櫚科、百合科、龍舌蘭科、仙人掌科、杜鵑花科、薯蕷科、景天科、龍膽科以及蕨類植物，大多將采用離體保存的方式進(jìn)行長(zhǎng)期有效的保存。植物離體材料是可供繁殖使用的非種子材料，包括試管苗、愈傷組織、塊根、根孽、塊莖、鱗莖、球莖、插條、珠芽、芽、不定芽、芽條、花粉、花藥、孢子及其它微繁殖體或培養(yǎng)物。

植物離體材料保存方法主要是常低溫保存法、冷凍保存法和-196℃的液氮罐保存法。對(duì)于大部分植物離體材料而言，主要采用常低溫保存法，而且更新的周期較短，因此，需要設(shè)置全自動(dòng)溫室，保證植物離體材料的定期更新。

植物組織培養(yǎng)等生物技術(shù)是植物離體保存所采用的主要技術(shù)手段，細(xì)胞水平和分子水平的手段也是植物離體保存的常規(guī)技術(shù)。

2.2 技術(shù)路線

植物離體種質(zhì)資源的保存，主要的技術(shù)路線：材料的準(zhǔn)備（選擇適宜的年齡與生長(zhǎng)狀態(tài)）、預(yù)處理（如預(yù)培養(yǎng)或低溫鍛煉）、將材料裝入試管（插入冰浴中0℃）、加入0℃預(yù)冷的冰凍保護(hù)劑、慢速（1℃/min）降溫到-30℃至-40℃、液氮保存、37℃至40℃水中快速化凍、TTC（檢測(cè)細(xì)胞活力）或再培養(yǎng)、觀測(cè)（恢復(fù)生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)量、存活率、植株再生、遺傳性狀分析）。

3 微生物種質(zhì)資源保存技術(shù)

3.1 技術(shù)原理

微生物種質(zhì)資源保存技術(shù)主要用于長(zhǎng)期、安全、有效地保存大型真菌種質(zhì)資源，同時(shí)適當(dāng)保存一定數(shù)量的放線菌和特殊生境微生物。

在微生物菌種的收集保存中，應(yīng)根據(jù)物種的特性，采用多種保存方法，取長(zhǎng)補(bǔ)短，以達(dá)到長(zhǎng)期、安全、有效地保存種質(zhì)資源目的。常用的方法有菌種轉(zhuǎn)接法、礦物油保存法、凍干法和液氮保存法等［4］。

3.2 技術(shù)路線

技術(shù)路線包括微生物種質(zhì)采集、分離、純化、分類鑒定、入庫(kù)保存，定期進(jìn)行菌種的復(fù)壯及活力檢測(cè)，并建立相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)等。具體技術(shù)路線詳見(jiàn)圖1。

圖1 微生物種質(zhì)資源保存技術(shù)路線

4 動(dòng)物種質(zhì)資源保存技術(shù)

4.1 技術(shù)原理

動(dòng)物種質(zhì)資源主要以保存珍稀瀕危特有的野生動(dòng)物種質(zhì)資源（精液、卵細(xì)胞和胚胎細(xì)胞）為主，野生近緣種和特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的種質(zhì)資源為輔。有些野生動(dòng)物的種質(zhì)資源非常難以收集，這時(shí)可以先收集野生動(dòng)物的組織（特定組織的細(xì)胞系或生殖細(xì)胞），對(duì)組織材料進(jìn)行低溫保存，同時(shí)可以對(duì)組織細(xì)胞建立細(xì)胞系或株。動(dòng)物種質(zhì)資源以深低溫液氮保存為主，作為暫時(shí)保存，也可考慮用－80℃冰箱保存［5］。

4.2 技術(shù)路線

主要技術(shù)路線包括采集、檢測(cè)活力、降溫（不同種質(zhì)材料選用不同的防凍劑和防凍模式）、液氮保存、定期復(fù)蘇及活力檢測(cè)，并在信息系統(tǒng)中輸入相應(yīng)的數(shù)據(jù)和信息。

采用非損傷性方法，采集不同的動(dòng)物種質(zhì)材料，通過(guò)液氮深低溫冷凍保存方法，長(zhǎng)期保存動(dòng)物種質(zhì)資源。對(duì)不同的種質(zhì)材料，應(yīng)采用不同的方法來(lái)采集和保存。用注射器抽取血樣，全血低溫保存；采用耳部打孔辦法，采集皮膚樣品，建立成纖維細(xì)胞，液氮保存；采用電刺激或假陰道法采集精液，用非手術(shù)方法采集卵細(xì)胞，以合適的防凍液處理，液氮保存。

具體步驟：制定采集、申請(qǐng)?jiān)S可、野外捕獲動(dòng)物、樣品采集(皮膚、血液、生殖細(xì)胞）、樣品迅速運(yùn)送到中心庫(kù)、質(zhì)量檢查、數(shù)據(jù)錄入、樣品入庫(kù)、細(xì)胞系建立、低溫保存、定期質(zhì)量控制、樣品復(fù)份保存、樣品的分發(fā)和相關(guān)研究開(kāi)發(fā)。

5 DNA種質(zhì)資源保存技術(shù)

5.1 技術(shù)原理

由于DNA材料的量很小，將采用-80℃的低溫冰箱或液氮儲(chǔ)藏的方法［6］。

DNA種質(zhì)資源保存庫(kù)主要保存無(wú)法通過(guò)種子庫(kù)、離體庫(kù)或微生物種質(zhì)資源庫(kù)保存的生物種質(zhì)材料。DNA的提取、純化，在收集到組織材料后分步實(shí)施。

5.2 技術(shù)路線

總DNA保存步驟：種質(zhì)材料、提取總DNA、檢測(cè)DNA的純度及大小、冷凍干燥、-80℃保存/液氮罐。

［1］呂植.西藏生物多樣性保護(hù)與管理［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2000：1-2.

［2］張峰，張教洪，閆樹(shù)林，等.藥用植物種質(zhì)資源保存技術(shù)規(guī)程［J］.種子，2012，31（9）：69－70.

［3］文彬.植物種質(zhì)資源超低溫保存概述［J］.植物分類與資源學(xué)報(bào)，2011，33（03）:311-329.

［4］寧國(guó)贊.我國(guó)農(nóng)業(yè)微生物種質(zhì)資源收集保藏利用現(xiàn)狀及發(fā)展前景［A］.第九屆全國(guó)土壤微生物學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要［C］.全國(guó)土壤微生物學(xué)術(shù)討論會(huì)，2001，5.

［5］燕海峰，肖兵南，等.家禽種質(zhì)資源保存研究［J］.畜禽業(yè)，2003（08）:21-23.

［6］房經(jīng)貴.DNA保存在果樹(shù)種質(zhì)資源保存中的利用策略［A］.中國(guó)園藝學(xué)會(huì).中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第四屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集［C］.中國(guó)園藝學(xué)會(huì)，2000:5.