傣藥對葉豆葉山柰酚的含量測定

姜明輝 西雙版納州食品藥品檢驗所，云南　景洪　666100

傣藥對葉豆葉為豆科植物翅莢決明CassiaalataLinn.的干燥葉，西雙版納傣醫(yī)稱“芽拉勐龍” ，其味淡，性寒，入水塔。具有清火解毒，消腫止痛，殺蟲止癢之功。用于風火水毒過盛所致的咽喉腫痛，口舌生瘡；疔瘡腫痛，疥癬，濕疹；六淋證出現(xiàn)的尿頻、尿急、尿痛；痔瘡出血；腹瀉，痢疾；骨折[1]。文獻報道[2]其葉含有金圣草素、山柰酚、槲皮素、5,7,4＇-三羥基二氫黃酮等黃酮類成分，標準收載于《云南省中藥材標準》(2005年版第三冊·傣族藥)。目前，未見對葉豆葉山柰酚含量測定的報道，按《中國藥典》2015年版四部通則[3]現(xiàn)建立對葉豆葉山柰酚含量測定方法，為對葉豆葉質(zhì)量標準的提高提供參考方法和依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器Agilent高效液相色譜儀(G4214B-1260DAD；G1316A-1230TCC；G1329-1260ALS；G1311C-1260 QuatpumpVL)；島津UV-2550紫外可見光分光光度計；101-EBS電熱鼓風干燥箱。

1.2材料不同產(chǎn)地的五批藥材于2014年2月至10月分別采自西雙版納州景洪市、勐?？h、勐臘縣。詳見表1。由西雙版納州食品藥品檢驗所彭霞主任藥師鑒定為豆科植物翅莢決明CassiaalataLinn.的干燥葉。

山柰酚對照品(批號：110861-201310，中國食品藥品檢定研究院，含量按93.2%計)。甲醇、乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；水為超純水(自制)。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性考察色譜柱：Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸(22∶78)；流速：1 mL/min；檢測波長：366 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；理論板數(shù)以山柰酚計應不低于3000。如圖1、2所示。

2.2對照品儲備液的制備精密稱取山柰酚對照品適量，置于100 mL量瓶中，用甲醇制成每1 mL含30μg的溶液，搖勻，即得。

2.3供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加80%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)45min，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密量取山柰酚對照品儲備液(濃度為376.714 40μg / mL)，配制成濃度分別為376.71440、301.37152、263.70008、207.19292、150.68576、103.59646、75.34288、60.27430、45.20573、30.13715、22.60286、15.06858、10.54800、3.01372μg /mL的對照品溶液，分別進樣10 μl ，以進樣濃度Y(μg /mL)為橫坐標，峰面積X為縱坐標，經(jīng)回歸處理，回歸方程：Y=39.522x-15.458，r2=0.9999，試驗結(jié)果表明山柰酚在3～200μg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗取6份對葉豆葉藥材(西雙版納勐臘縣勐侖鎮(zhèn)，批號：20140831)，精密稱定，按“2.3”項下方法操作，依次測定，對葉豆葉藥材的平均含量為0.148%，RSD為0.36%。

2.6重復性試驗精密量取2.2 項下對照品液10μL，按照上述色譜條件連續(xù)進樣7次，以峰面積值計算RSD為1.04%，結(jié)果符合要求。

2.7穩(wěn)定性試驗取同一批次的供試品溶液(產(chǎn)地：西雙版納州勐臘縣勐侖鎮(zhèn)，批號：20140831)，在0、2、6、12、18、24 h進樣測定，測得山柰酚峰面積的RSD為1.44%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗取具塞錐形瓶6個，分別精密加入山柰酚對照品0.40 mg精密稱取已知含量的樣品(西雙版納勐臘縣勐侖鎮(zhèn) 批號：20140831)0.25 g，分別加入上述6個具塞錐形瓶中，按“2.3”項下方法操作，按上述色譜條件測定，計算回收率。該分析方法的回收率為97.42%～102.99%，且RSD為1.64%，符合要求。

2.9樣品測定取不同產(chǎn)地5批對葉豆葉，按照上述方法制備供試品溶液，分別測定西雙版納州內(nèi)5批樣品，按干燥品計算本品的含量，測定結(jié)果見表1。

表1　不同產(chǎn)地對葉豆葉山柰酚的含量　(n=2)

3　討論

3.1檢測波長的選擇取山柰酚對照品溶液，在190 ～ 400 nm的范圍內(nèi)掃描，結(jié)果山柰酚在365.6 nm、325.10 nm、266.10 nm處有吸收峰。其他條件不變的情況下，根據(jù)山柰酚在二極管陣列檢測器上得到的紫外吸收光譜圖，366 nm峰面積比325 nm、266 nm峰面積大；分離效果更好。因此確定該方法的測定波長為366 nm。

3.2流動相的選擇以乙腈-0.1%甲酸(22∶78)、乙腈-0.2%磷酸(32∶68)、甲醇-0.1%甲酸(22∶78)、甲醇-0.4%磷酸(50∶50)、甲醇-0.4%磷酸-四氫呋喃(40∶50∶10)為流動相依法測定，結(jié)果以乙腈-0.1%甲酸(22∶78)為流動相，各組分分離好，基線較穩(wěn)定。

3.3提取條件的考察實驗考察了甲醇、乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇為溶劑，采用回流提取(提取時間為60 min、90 min、120 min)、超聲處理(超聲時間為30 min、45 min、60 min)制備供試品溶液。結(jié)果表明，以80%乙醇為溶媒，超聲處理45 min，對葉豆葉中山柰酚的溶出量最大。

3.4耐用性試驗按《中國藥典》2015年版第四版通則9101 “藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則”，考察了不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、不同生產(chǎn)廠家的色譜柱(依利特 Hypersil ODS2(150×4.6 mm, 5.0 μm)、Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm))、不同檢測波長(361 nm、366 nm、371 nm)、不同流速(0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min)，結(jié)果表明，上述因素對保留時間有明顯影響，但對峰面積積分值無明顯影響，對被測成分色譜峰的分離度、拖尾因子無明顯影響。

綜上，本文建立HPLC法測定對葉豆葉中山柰酚的含量方法，同時測定了對西雙版納州景洪市、勐?？h、勐臘縣五個產(chǎn)地五批對葉豆葉藥材含量，結(jié)果顯示，各個產(chǎn)地的含量有差異。此方法經(jīng)方法學驗證，可為對葉豆葉藥材標準的進一步提高，提供方法依據(jù)。

[1]云南省食品藥品監(jiān)督管理局.云南省中藥材標準(第三冊)[M].昆明：云南科技出版社，2005：37.

[2]劉安，徐麗珍，鄒忠梅，等.對葉豆黃酮類化學成分研究[J]. 中國中藥雜志，2009，34(7):861-863.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(四部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：374-377.