高通量測序分析紅棕紫泥土土壤細菌多樣性

王 謝，張建華*，龐良玉，林超文，唐 甜，許文志，楊育林，向成華

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所, 四川 成都 610066; 2. 四川省林業(yè)科學研究院, 四川 成都 610081 )

【研究意義】土壤微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)元素循環(huán)、有機物質(zhì)的形成和分解、土壤肥力的保持和提高、生態(tài)環(huán)境改善、植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)、作物病蟲害防治等方面起著極其重要的作用[1]。其中，土壤細菌是土壤微生物的重要組成部分，在土壤有機質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成、養(yǎng)分轉化與吸收等過程中起到重要作用，其群落結構組成及其多樣性變化是表征土壤環(huán)境質(zhì)量的敏感指標[2]。紅棕紫泥土為四川盆地丘陵區(qū)坡耕地主要的土壤類型，了解其土壤細菌群落結構，有助于了解區(qū)域土壤健康狀況、和發(fā)揮土壤潛在的肥力和生態(tài)功能，為區(qū)域農(nóng)林產(chǎn)品質(zhì)量的提升和農(nóng)田的可持續(xù)利用提供重要的參考依據(jù)。【前人研究進展】由于土壤微生物物種豐富、很多難以培養(yǎng)、且功能多樣，利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)、分離純化得到的微生物種群僅占土壤整個微生物群落的1 %[3]。【本研究切入點】目前，第二代測序技術已經(jīng)成為微生物群落結構研究的重要手段，利用高通量測序可檢測到環(huán)境中大量的不可培養(yǎng)的微生物存在, Rosello等估計每克土壤約含有幾千種微生物[4]。【擬解決的關鍵問題】本文以四川資陽土壤保護站坡耕地的紅棕紫泥土為研究對象，利用16S擴增子高通量測序技術，對其土壤細菌群落構成和多樣性進行研究，以期為未來進一步研究該地區(qū)土地利用方式與土壤生態(tài)功能調(diào)控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

土壤樣品于 2016年8月采集于四川省資陽市響水村(30°6’18.17” N，104°35’36.70”E， 405 m)，該地區(qū)地貌以丘陵地形為主，氣候為亞熱帶季風氣候類型，年平均氣溫17 ℃，年平均降水量874 mm，年無霜期約311 d。

1.2 樣地設置

選擇附近3個典型的丘體，分別標為S1、S2和S3。在連續(xù)1周晴天后，按照樣線法[5]在其長期旱作的坡耕地上采集土壤樣品，共設置樣線 5條，用土芯取樣器采集表層0～40 cm土壤。最后，根據(jù)丘體和樣線進行編號，用四分法混合后取樣帶回。測序土樣裝入100 mL離心管中，-4 ℃下保存帶回實驗室待測。

試驗土壤為侏羅紀遂寧組母質(zhì)發(fā)育的紅棕紫泥，長期種植模式為小麥套種玉米套種甘薯，土層厚40～60 cm，土壤層次分化不明顯，測試土壤理化性質(zhì)參見表1。

1.3 DNA提取及測序

準確稱取0.1 g土樣，采用MoBio試劑盒法，提取土樣的總DNA。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳測定DNA完整性、MiniDorp測定DNA純度和濃度。每個樣地的5份DNA樣品隨機取3份等量混勻，分別制成3個平行樣本，于-20 ℃保存、備用。

參考Caporaso等[6]的方法，通過細菌16S rDNA V4區(qū)段引物來擴增各樣品，其引物為515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。DNA擴增條件為98 ℃預變性1 min，98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min[7]。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

將所測得原始序列截去Barcode序列和引物序列，利用FLASH(V1.2.7)[8]拼接獲得原始Tags數(shù)據(jù)；利用Qiime(V1.7.0)[9]軟件過濾處理原始Tags數(shù)據(jù)獲得高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)，并與Gold database數(shù)據(jù)庫進行比對，檢測并去除其中的嵌合體序列[10]，獲得有效數(shù)據(jù)。測序深度為每個文庫原始reads數(shù)不少于4萬條，以97 %相似性為依據(jù)，利用UPARS Epipeline軟件將各序列聚類成為可執(zhí)行的分類操作單位(Operational taxonomic units，OTUs)。

為獲得土壤樣品中微生物物種的多樣性信息，用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)，統(tǒng)計界、門、綱、目、科、屬和種7個分類水平上的樣本的群落組成。使用PyNAST(V1.2)軟件與GreenGene數(shù)據(jù)庫中的 "Core Set" 數(shù)據(jù)信息進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。最后使用Qiime(V1.7.0)軟件計算土壤樣本微生物群落α多樣性的相關指數(shù)，用Chao1指數(shù)和ACD指數(shù)表征菌群豐度，用Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)表征菌群多樣性。

2 結果與分析

2.1 檢測到的可執(zhí)行的分類操作單位

測序分析得到51 806～66 508條原始數(shù)據(jù)，其中有效序列占98.52 %～98.93 %，最小長度為44 bp，最大長度為389 bp，平均長度253 bp。有效數(shù)據(jù)進行聚類，得到4296個OUT。其中，細菌界的相對豐度為98.91 %，古菌界的相對豐富度為1.09 %。所檢測到的細菌占所有分類物種的(11.39±1.64) %。

表1 供試土壤的化學性質(zhì)

所有樣品同時存在的有25個大的類群，分別是變形菌、擬桿菌、酸桿菌、厚壁菌、放線菌、芽單胞菌、疣微菌、浮霉菌、綠彎菌、藍菌、單糖菌、硝化螺旋菌、奇古菌、裝甲菌、綠菌、匿桿菌、JL-ETNP-Z39、衣原體、迷蹤菌、熱微菌、儉菌、TM6、食氫菌、螺旋體菌和纖維桿菌。此外，WCHB1-60、熱袍菌、SHA-109、嗜熱絲菌和同力菌存在于某兩座丘體坡耕地土壤中，異常球菌-棲熱菌、SM2F11、無壁菌、烏斯古菌、Candidate division OP3和暗黑菌僅存在于某一座丘體坡耕地土壤中。

2.2 門水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

在門水平上，相對豐富度排名前10的依次分別為變形菌門(49.52 %±4.60 %)、酸桿菌門(11.55 %±3.01 %)、擬桿菌門(10.87 %±1.65 %)、放線菌門(6.12 %±1.58 %)、芽單胞菌門(5.42 %±2.00 %)、疣微菌門(3.75 %±0.93 %)、厚壁菌門(2.4 %±0.92 %)、浮霉菌門(2.29 %±0.78 %)、綠彎菌門(2.03 %±0.84 %)和奇古菌門(1.09 %±0.10 %)。

2.3 綱水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

在綱水平上，相對豐富度排名前10的依次分別為β-變形菌綱(17.29 %±2.42 %)、γ-變形菌綱(13.16 %±2.42 %)、α-變形菌綱(11.92 %±2.78 %)、未鑒定的酸桿菌綱(10.04 %±2.89 %)、δ-變形菌綱(6.86 %±1.76 %)、鞘脂桿菌綱(5.59 %±1.15 %)、未鑒定的芽單胞菌綱(5.42±2.00 %)、纖維菌綱(4.07 %±0.48 %)、未鑒定的放線菌綱(4.03 %±1.42 %)和OPB35 soil group(2.29 %±0.57 %)。

2.4 目水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

在目水平上，相對豐富度排名前10的依次分別為伯克氏菌目(12.75 %±2.44 %)、黃單胞菌目(10.76 %±1.00 %)、Subgroup 6(5.93 %±1.44 %)、鞘脂桿菌目(5.59 %±1.15 %)、鞘脂單胞菌目(4.55 %±0.63 %)、噬纖維菌目(4.05 %±0.47 %)、芽單胞菌目(3.92 %±1.24 %)、粘細菌目(3.83 %±0.73 %)、Subgroup 4(2.9 %±1.06 %)和根瘤菌目(2.78 %±0.83 %)。

2.5 科水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

在科水平上，相對豐富度排名前10的依次分別為叢毛單胞菌科(8.99 %±2.44 %)、黃色單胞菌科 (8.33 %±0.79 %)、鞘脂單胞菌科(4.17 %±0.64 %)、Chitinophagaceae科(4.14 %±0.70 %)、芽單胞菌科(3.92 %±1.24 %)、噬纖維菌科(3.87 %±0.58 %)、草酸桿菌科(2.57 %±0.57 %)、亞硝化單胞菌科(1.55 %±0.35 %)、柄桿菌科(1.51 %±0.76 %)和RB41(1.40 %±0.50 %)。

2.6 屬水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

在屬水平上，相對豐富度排名前10的依次分別為溶桿菌屬(6.67 %±0.61 %)、鞘氨醇單胞菌屬(3.37 %±0.20 %)、Flavisolibacter屬(1.45 %±0.33 %)、馬賽菌屬(1.40 %±0.37 %)、Ohtaekwangia屬(1.29 %±0.07 %)、Blastocatella屬(1.12 %±0.46 %)、厭氧粘細菌屬(1.01 %±0.47 %)、芽單胞菌屬(0.97 %±0.34 %)、Pseudoduganella屬(0.92 %±0.36 %)和波單胞菌屬(0.84 %±0.53 %)。

2.7 種水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

在種水平上，相對豐富度排名前10的依次分別為變棕溶桿菌(0.82 %±0.98 %)、睪丸酮叢毛單胞菌(0.58 %±0.22 %)、厭氧性粘菌Fw109-5基因種(0.46 %±0.24 %)、日本硝化螺旋菌(0.36±0.15 %)、Steroidobacter菌WWH78基因種(0.36 %±0.05 %)、墨西哥假黃單胞菌(0.36 %±0.22 %)、Ellin517細菌(0.30 %±0.11 %)、莫氏根瘤菌(0.20 %±0.15 %)、疣微菌OR-59基因種(0.18 %±0.07 %)和纖維化纖維菌(0.17 %±0.10 %)。

2.8 土壤細菌群落α多樣性

就局域均勻生境下土壤細菌的物種數(shù)目而言，紅棕紫泥土中土壤細菌的物種組成復雜、多樣。在菌群豐度上，Chao指數(shù)為(2738.54±83.04)種，ACE指數(shù)為(2743.72±73.80)種；在菌群的多樣性上，Shannon多樣性指數(shù)為9.05±0.06，Simpson多樣性指數(shù)為0.99±0.0008。

3 討 論

3.1 變形菌、酸桿菌、擬桿菌為紅棕紫泥土優(yōu)勢類群

本研究發(fā)現(xiàn)紅棕紫泥土中細菌以變形菌為主，約占所有細菌的50 %，其次為酸桿菌和擬桿菌，這三類型細菌占左右細菌的近70 %。該結果與其他一些土壤細菌多樣性的研究結果相似，如朱英波等[11]指出變形菌和酸桿菌是黑龍江農(nóng)田土壤細菌的優(yōu)勢菌群；韓晶等[12]指出變形菌和擬桿菌為博樂河入口濕地的優(yōu)勢菌群，兩者約占總克隆的65 %；張建萍等[13]指出變形菌占寧夏地區(qū)稻田土壤細菌的比例最大(37.8 %), 其次為酸桿菌(16.2 %)、放線菌(12.2 %)和擬桿菌(10.8 %)。

3.2 變形菌的生態(tài)學功能

變形菌種類繁多且生態(tài)功能多樣，對環(huán)境具有極強的適應性和變異性[14]。就本文中豐富度最高的叢毛單胞菌科和黃色單胞菌科細菌為例。叢毛單胞菌隸屬變形菌β亞綱，這一類細菌對于酚類、喹啉類等污染物的降解很早就被研究人員發(fā)現(xiàn)，但由于遺傳背景的差異性, 不同的叢毛單胞菌可降解的污染物及降解特性都有所不同[15]。黃色單胞菌科隸屬變形菌γ亞綱，雖然是侵染葉片、誘發(fā)細菌性疫病的主要病原菌，但可用于農(nóng)藥降解[16]。

3.3 酸桿菌的生態(tài)學功能

酸桿菌是新近分出的一類細菌, 目前對它們研究還很少, 其在遺傳和代謝上具有很高的多樣性, 并在土壤等生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用[13, 17]。酸桿菌細菌一般具有嗜酸、寡營養(yǎng)、難培養(yǎng)的特點；但事實上并非如此，一些酸桿菌的基因序列也在中性、甚至堿性的環(huán)境中被檢測出來[18]，本文的土壤環(huán)境也為堿性環(huán)境(pH≈8.8)。雖然現(xiàn)階段酸桿菌在自然環(huán)境中的功能還知之甚少[18]，但有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酸桿菌具有許多編碼纖維素酶和半纖維素酶的基因[19]、部分菌種還具有異化鐵還原能力[20-21]。

3.4 擬桿菌的生態(tài)學功能

擬桿菌在人畜腸道中的絕對數(shù)量優(yōu)勢，具有的突出的糞源指示作用[22]。在土壤中，擬桿菌主要參土壤有機質(zhì)的分解[23]。張曉在研究林地恢復對土壤原核微生物群落結構的影響時也指出r策略細菌(變形菌門和擬桿菌門)的相對含量土壤碳凈礦化率成正比[24]。

4 結 論

紅棕紫泥土中土壤細菌的物種組成復雜、多樣，第一優(yōu)勢細菌類群為變形菌，第二優(yōu)勢細菌類群為酸桿菌和擬桿菌。

參考文獻：

[1]Gianfreda L, Sannino F, Violante A. Pesticide effects on the activity of free, immobilized and soil invertase[J]. Soil Biology & Biochemistry, 1995, 27(9):1201-1208.

[2]烏英嗄, 張貴龍, 賴 欣,等. 生物炭施用對華北潮土土壤細菌多樣性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2014, 33(5):965-971.

[3]Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.[J]. Microbiological Reviews, 1995, 59(1):143-69.

[4]Rossellómora R, Amann R. The species concept for prokaryotes[J]. Fems Microbiology Reviews, 2001, 25(1):39-67.

[5]Conklin A R 7. Soil and Soil Solution Sampling, Sample Transport, and Storage[M]// Introduction to Soil Chemistry: Analysis and Instrumentation, Second Edition. John Wiley & Sons, Inc, 2014:135-158.

[6]Caporaso J G, Lauber C L, Walters W A, et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms[J]. Isme Journal, 2012, 6(8):1621-1624.

[7]陶 蓮, 刁其玉. 青貯發(fā)酵對玉米秸稈品質(zhì)及菌群構成的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2016(1):198-207.

[8]Mago? T, Salzberg S L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J]. Bioinformatics, 2011, 27(21):2957-2963.

[9]Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods, 2010, 7(5):335-336.

[10]Bokulich N A, Sathish S, Faith J J, et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing[J]. Nature Methods, 2012, 10(1):57-59.

[11]朱英波, 史鳳玉, 張瑞敬,等. 黑龍江大豆輪作和連作土壤細菌群落多樣性比較[J]. 植物保護學報, 2014, 41(4):403-409.

[12]韓 晶, 胡文革, 王艷萍,等. 新疆艾比湖濕地博樂河入口處土壤細菌多樣性分析[J]. 微生物學通報, 2014, 41(11):2244-2253.

[13]張建萍, 董乃源, 余浩濱,等. 應用16S rDNA-RFLP方法分析寧夏地區(qū)稻田土壤細菌的多樣性[J]. 生物多樣性, 2008, 16(6):586-592.

[14]韓 晶. 艾比湖濕地原核微生物群落動態(tài)演替和優(yōu)勢群落組成變化對環(huán)境的響應的研究[D]. 石河子大學, 2014.

[15]趙 燕, 薛林貴, 李 琳,等. 叢毛單胞菌在環(huán)境污染物降解方面的研究進展[J]. 微生物學通報, 2012, 39(10):1471-1478.

[16]虞云龍, 樊德方, 陳鶴鑫. 農(nóng)藥微生物降解的研究現(xiàn)狀與發(fā)展策略[J]. 環(huán)境科學進展, 1996(3):28-36.

[17]Zhou J, Xia B, Huang H, et al. Bacterial phylogenetic diversity and a novel candidate division of two humid region, sandy surface soils[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2003, 35(7):915-924.

[18]王光華, 劉俊杰, 于鎮(zhèn)華,等. 土壤酸桿菌門細菌生態(tài)學研究進展[J]. 生物技術通報, 2016, 32(2):14-20.

[19]Kanokratana P, Uengwetwanit T, Rattanachomsri U, et al. Insights into the phylogeny and metabolic potential of a primary tropical peat swamp forest microbial community by metagenomic analysis[J]. Microbial Ecology, 2011, 61(3):518-528.

[20]Lu S P, Gischkat S, Reiche M, et al. Ecophysiology of Fe-cycling bacteria in acidic sediments.[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2010, 76(24):8174.

[21]Coupland K, Johnson D B. Evidence that the potential for dissimilatory ferric iron reduction is widespread among acidophilic heterotrophic bacteria[J]. Fems Microbiology Letters, 2008, 279(1):30.

[22]張 曦, 朱昌雄, 朱紅惠. 利用擬桿菌分子標記物對糞便污染溯源的研究進展[J]. 微生物學報, 2011, 51(7):863-868.

[23]艾 超. 長期施肥下根際碳氮轉化與微生物多樣性研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2015.

[24]張 曉. 自然恢復和人工林重建對土壤原核微生物群落結構和建群機制的影響[D]. 中國林業(yè)科學研究院, 2016.