馬鞍山地區(qū)耳聾相關(guān)基因變異分析

王棟魏澄 章雪芹 胡曉武

1馬鞍山市臨床檢驗(yàn)中心，馬鞍山市立醫(yī)療集團(tuán)(馬鞍山243000)

2馬鞍山市婦幼保健院，馬鞍山市立醫(yī)療集團(tuán)(馬鞍山243000)

耳聾是人類的常見疾病之一，與遺傳因素密切相關(guān)[1]。遺傳性耳聾分為綜合征型和非綜合征型，其中70%為非綜合征型。非綜合征型耳聾可以分為常染色體顯性(DFNA，15-20%)、常染色體隱性(DFNB，80%)、性連鎖(DFNX-linked、DFNY-linked，1%)和線粒體遺傳性耳聾(＜1%)四類[2]。迄今為止，超過200個(gè)綜合征型和非綜合征型耳聾基因被發(fā)現(xiàn)，但仍有大量的遺傳性耳聾致病基因不明確，而多數(shù)耳聾基因突變極為罕見，只在單個(gè)或極少數(shù)的家庭中被報(bào)道[1]。

馬鞍山市婦幼保健院兒保科聽力篩查中心對(duì)6060例新生兒進(jìn)行DPOAE+AABR聯(lián)合聽力篩查，經(jīng)聽力學(xué)診斷，聽力異常58例，聽力損失檢出率為9.57‰(58/6060)[3]。同時(shí)遺傳性耳聾基因篩查是新生兒聽力篩查很好的補(bǔ)充，有助于遲發(fā)性耳聾的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)防[4]。為了解地區(qū)人群中的耳聾相關(guān)基因位點(diǎn)變異信息，為聽力損失的遺傳學(xué)成因分析提供參考依據(jù)，本文通過檢出馬鞍山地區(qū)人群中GJB2、GJB3、SLC26A4和MT-RNR1基因位點(diǎn)的變異，分析各變異的頻率和基因型分布，探索聽力損失與正常聽力人群中的頻率分布差異，研究位點(diǎn)變異與聽力損失間的關(guān)系。本文參照HGVS命名規(guī)范[5-6]來描述所有的基因變異，其中c.512insAACG[7]描述為 c.508_511dup，605ins46[8]描述為c.559_604dup。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2014年12月-2017年2月于馬鞍山市臨床檢驗(yàn)中心接受遺傳性耳聾基因芯片檢測(cè)的共2705名受檢者，包括馬鞍山市婦幼保健院及市人民醫(yī)院出生的新生兒2633名，市婦幼保健院兒?？坡犃Y查中心門診的嬰幼兒及成人72名。新生兒的平均日齡為3.31±1.02天，門診嬰幼兒及成人的年齡1月至29歲不等，年齡中位數(shù)為3個(gè)月。男性共1439名，女性共1266名。經(jīng)聽力學(xué)評(píng)估確診為聽力損失的共58名。經(jīng)Sanger測(cè)序檢測(cè)的受檢者共386名，其中GJB2基因測(cè)序的有277名，GJB3基因測(cè)序的有46名，SLC26A4基因測(cè)序的有97名，MT-RNR1基因測(cè)序的有76名，部分受檢者對(duì)兩個(gè)及兩個(gè)以上的基因進(jìn)行測(cè)序。所有受檢者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集及處理

新生兒受檢者采集足跟血，門診受檢者采集2mLEDTA抗凝全血后，在空白濾紙片上制成血斑標(biāo)本。人基因組DNA提取采用北京天根生化科技有限公司的干血斑基因組DNA提取試劑盒，操作步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.2 熱點(diǎn)致病變異的檢測(cè)

應(yīng)用博奧生物有限公司的晶芯九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒(微陣列芯片法)檢測(cè)中國人群中的四個(gè)耳聾相關(guān)基因上的九個(gè)熱點(diǎn)致病變異，即GJB2c.35del、c.176_191del、c.235del、c.299_300del，GJB3c.538C＞T，SLC26A4c.919-2A＞G、c.2168A＞G，MT-RNR1m.1494C＞T、m.1555A＞G。配合芯片洗干儀、微陣列芯片掃描儀和判別軟件對(duì)芯片進(jìn)行清洗、掃描和結(jié)果判讀。對(duì)判讀結(jié)果中的所有陽性標(biāo)本和隨機(jī)挑選的部分陰性標(biāo)本，送至北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger法測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 其它位點(diǎn)變異的檢測(cè)

參考四個(gè)耳聾相關(guān)基因的NCBI參考序列，對(duì)測(cè)序結(jié)果的所有序列文件進(jìn)行MegAlign比對(duì)，去除測(cè)序帶來的前后段差異，截選中段的一致序列作為每個(gè)基因的可監(jiān)測(cè)區(qū)域。選擇野生型作為參考峰圖，應(yīng)用Mutation Surveyor 2.28軟件查找其余峰圖中的位點(diǎn)變異。位點(diǎn)變異及其臨床表征參考NC?BIdbSNP數(shù)據(jù)庫Build 141(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)和耳聾變異數(shù)據(jù)庫Version 8(http://deafness?variationdatabase.org)。應(yīng)用的其他生物信息學(xué)軟件包括 Chromas 2.11、DNA STAR 7.10和 DNA?MAN8。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

最小等位基因頻率MAF計(jì)算的是總樣本群體中的不常見等位基因的發(fā)生頻率，計(jì)算公式為MAF=(低頻純合子×2+雜合子)/(總樣本數(shù)×2)。總樣本群體不區(qū)分聽力表型，僅區(qū)分基因型，相同基因型的聽力損失組與正常聽力組人數(shù)相加。總樣本群體是否符合Hardy-Weinberg平衡采用卡方檢驗(yàn)，P＞0.05表示符合。應(yīng)用SPSS 19.0軟件，比較兩組間的熱點(diǎn)致病變異檢出率，采用校正卡方檢驗(yàn)；應(yīng)用SHEsis軟件分析各位點(diǎn)變異的基因型頻率組間差異，采用Fisher精確檢驗(yàn)；應(yīng)用Haploview 4.2軟件分析連鎖不平衡，rs2274084和rs2274083的單體型分布頻率組間差異采用卡方檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 聽力學(xué)診斷及分組

采用美國智聽公司HIS SmartEP誘發(fā)電位儀和美國GSI-39中耳分析儀進(jìn)行雙耳ABR和聲導(dǎo)抗檢查。其中新生兒聽力檢查采用DPOAE+AABR聯(lián)合篩查，連續(xù)兩次未通過DPOAE和/或AABR篩查者，無論是單雙耳均進(jìn)行聽力學(xué)診斷[3-4]。將ABR V波閾值＞30dB nHL納入聽力損失組，其余歸為正常聽力組。

2 結(jié)果

2.1 熱點(diǎn)致病變異與聽力損失間的關(guān)系

聽力損失組的熱點(diǎn)致病變異檢出率達(dá)24.14%(14/58)，遠(yuǎn)高于正常聽力組的檢出率5.21%(138/2647)，同時(shí)熱點(diǎn)致病變異被檢出者的聽力損失檢出率達(dá)9.21%(14/152)，高于未被檢出者的檢出率1.72%(44/2553)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000＜0.001)，見表1。

2.2 熱點(diǎn)致病變異的等位基因頻率、基因型分布及組間頻率差異

大多數(shù)熱點(diǎn)致病變異的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡，盡管受檢者完全一致，但GJB2c.235del分布并不符合H-W平衡(P=0.000＜0.001)。剔除門診受檢者后以新生兒統(tǒng)計(jì)，P=0.028，仍然不符合。一方面可能是由于72名門診受檢者中有7名c.235del雜合和2名c.235del純合，另一方面可能是c.235del本身在受檢者中具有較高比例變異的原因。

九個(gè)熱點(diǎn)致病變異中GJB2c.235del的檢出率最高，約占檢出總數(shù)的46.05%(70/152)，其次是SLC26A4c.919-2A＞G，約占 24.34%(37/152)，未檢出GJB2c.35del和MT-RNR1m.1494C＞T。同時(shí)檢出2名GJB2c.235delC并SLC26A4c.919-2A＞G雙雜合，1名SLC26A4c.919-2A＞G雜合并MT-RNR1m.1555A＞G均質(zhì)。GJB2基因變異約占熱點(diǎn)致病變異總數(shù)的58.06%(90/155)，其次是SLC26A4基因，約占27.74%(43/155)。

熱點(diǎn)致病變異中，雜合型變異較純合型多見，多數(shù)分布在聽力正常人群中。4名GJB2c.235del純合型都被確診為聽力損失。3名MT-RNR1m.1555A＞G均質(zhì)型和7名異質(zhì)型都未發(fā)生聽力損失，對(duì)氨基糖苷類藥物敏感性個(gè)體及其母系親屬的預(yù)防宣教，成為預(yù)防其發(fā)生聽力損失的一種有效手段。GJB2c.176_191del和c.235del基因型頻率的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022＜0.05、P=0.000＜0.001)，見表2。

2.3 四個(gè)耳聾相關(guān)基因其他位點(diǎn)的變異

2.3.1GJB2基因其他位點(diǎn)變異的基因頻率、基因型分布及組間差異

參考NM_004004.5，對(duì)277名GJB2基因測(cè)序的序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，得到GJB2基因可監(jiān)測(cè)區(qū)域?yàn)槠湔麄€(gè)編碼序列1-681bp，除4個(gè)熱點(diǎn)致病變異外，其上共檢出14個(gè)其他位點(diǎn)變異，見圖1。

表1 熱點(diǎn)致病變異與聽力損失間的關(guān)系(n=2705)Table 1 Relationship between hotspotpathogenic variationsand hearing loss(n=2705)

圖1 GJB2基因可監(jiān)測(cè)區(qū)域上的各位點(diǎn)變異(斜線框表示可監(jiān)測(cè)區(qū)域，下文同)Fig.1 Site variationson the detectable region of GJB2(Slash box stands for the detectable region.The follow ing are the same)

圖2 GJB3基因可監(jiān)測(cè)區(qū)域上的各位點(diǎn)變異Fig.2 Site variationson the detectable region of GJB3

各位點(diǎn)都符合Hardy-Weinberg平衡。c.79G＞A和c.341A＞G的MAF高于20%，以常見多態(tài)的形式存在于人群中，組間頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.630＞0.05，P=0.541＞0.05)。c.109G＞A的MAF高于5%，基因型頻率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000＜0.001)，與耳聾變異數(shù)據(jù)庫中的變異類型相吻合。3名c.109G＞A純合型都被確診為聽力損失。c.608T＞C的MAF高于1%，雜合型在兩組間的人數(shù)分布大致相當(dāng)，組間頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.451＞0.05)，見表3。

c.368C＞A和c.478G＞A僅在正常聽力組中檢出，c.282C＞T、c.283G＞A、c.427C＞T、c.508_511dup、c.559_604dup、c.571T＞C和c.598G＞A僅在聽力損失組中檢出，除c.368C＞A外，這些位點(diǎn)的MAF都不大于0.5%，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)P值都大于0.05，組間基因型頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表4列出了帶有這些少見變異的不同GJB2基因型。結(jié)合表3中的變異類型，對(duì)有c.257C＞G、c.283G＞A、c.427C＞T、c.559_604dup和c.598G＞A變異的聽力損失患者，建議其父母進(jìn)行相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)，以明確該復(fù)合雜合是順式還是反式，便于對(duì)耳聾病因做出合理的解釋。

對(duì)常見多態(tài)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)c.79G＞A(rs2274084)和 c.341A＞G(rs2274083)的 D’=0.948、r2=0.604，說明存在較弱的連鎖不平衡，但各單體型頻率組間差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(卡方檢驗(yàn)的P值都大于0.05)，見表5。

2.3.2GJB3基因其他位點(diǎn)變異的基因頻率、基因型分布及組間差異

參考NM_024009.2，對(duì)46名GJB3基因測(cè)序的序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，得到GJB3基因可監(jiān)測(cè)區(qū)域?yàn)槠渚幋a序列后半部分區(qū)域211-813bp，除1個(gè)熱點(diǎn)致病變異外，其上僅檢出c.357C＞T，見圖2。

c.357C＞T是同義變異，不影響氨基酸組成，屬于良性變異，其MAF大于10%，屬于常見SNP位點(diǎn)，符合Hardy-Weinberg平衡，組間頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.809＞0.05)，見表6。

2.3.3SLC26A4基因其他位點(diǎn)變異的基因頻率、基因型分布及組間差異

SLC26A4基因測(cè)序的有97名，測(cè)序結(jié)果共104條。參考NG_008489.1，對(duì)其中的75條序列進(jìn)行比對(duì)，得到SLC26A4基因的第一段可監(jiān)測(cè)區(qū)域?yàn)?號(hào)外顯子、7號(hào)內(nèi)含子和8號(hào)外顯子全段(27568-27903bp)，對(duì)其余的29條序列進(jìn)行比對(duì)，得到第二段可監(jiān)測(cè)區(qū)域?yàn)?9號(hào)外顯子全段(54420-54565bp)，除2個(gè)熱點(diǎn)致病變異外，僅檢出c.919-18T＞G，見圖3。

圖3 SLC26A4基因可監(jiān)測(cè)區(qū)域上的各位點(diǎn)變異(網(wǎng)格框表示外顯子)Fig.3 Site variationson the detectable region of GJB3(Grid box stands for theexon)

c.919-18T＞G 的 MAF小于 1%，符合 Har?dy-Weinberg平衡，組間頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000＜0.001)，見表7。

2.3.4MT-RNR1基因其他位點(diǎn)變異的基因頻率、基因型分布及組間差異

圖4 MT-RNR1基因可監(jiān)測(cè)區(qū)域上的各位點(diǎn)變異Fig.4 Site variationson the detectable region of MT-RNR1 RNR1是線粒體基因，線粒體屬于母系遺傳，因

參考NC_012920.1，對(duì)76名MT-RNR1基因測(cè)序的序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，得到MT-RNR1基因可監(jiān)測(cè)區(qū)域?yàn)槠渚幋a序列后半段1333-1601bp，除2個(gè)熱點(diǎn)致病變異外，其上共檢出6個(gè)其他位點(diǎn)變異，見圖4。此不能使用Hardy-Weinberg平衡校驗(yàn)所選群體是否具有代表性。除m.1438A＞G外，各變異的檢出人數(shù)僅1-2名，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)P值都大于0.05，基因型分布組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，變異以均質(zhì)和良性多見，但考慮到各變異的檢出人數(shù)極少，可能存在著個(gè)例，判斷可能會(huì)有失真。m.1438中的A是祖先型等位，G是新生型等位，人群中以新生型等位為主，見表8。

3 討論

新生兒聽力篩查擁有良好的基礎(chǔ)設(shè)施和隨訪機(jī)制，為遺傳性耳聾基因篩查的實(shí)施提供了較多的便利，從而實(shí)現(xiàn)兩者的聯(lián)合篩查。新生兒聽力及耳聾基因聯(lián)合篩查的實(shí)施，將為減少我國耳聾殘疾人做出重要的貢獻(xiàn)[9]。本文研究對(duì)象都是馬鞍山市臨床檢驗(yàn)中心遺傳性耳聾基因篩查的受檢者，且都在馬鞍山市婦幼保健院兒?？坡犃Y查中心進(jìn)行了新生兒聽力篩查或者聽力學(xué)診斷。受檢者中有2633名新生兒，占總數(shù)的97.3%(2633/2705)，門診中有部分嬰幼兒是在42天復(fù)篩未通過時(shí)進(jìn)行的遺傳性耳聾基因篩查，有部分是2-6個(gè)月行聽力診斷時(shí)進(jìn)行的，因此可以說本文研究人群就是馬鞍山地區(qū)的新生兒，是基于新生兒個(gè)體的群體分析，受家系影響成分非常小。且除GJB2c.235del外的其余各變異的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡，說明本研究選擇的樣本具有群體代表性。

表2 熱點(diǎn)致病變異的最小等位基因頻率、基因型分布及組間頻率差異(n=2705)Table2 The MAF of hot spot pathogenic variations,distribution of genotypes and differences in genotype frequencies bet ween two groups(n=2705)

表3 GJB2基因其他位點(diǎn)變異的最小等位基因頻率、基因型分布及組間頻率差異(n=277)Table3 The MAF of other site variations in GJB2,distribution of genotypes and differences in genotype frequencies bet ween two groups(n=277)

本文采用的是多重等位基因特異性PCR結(jié)合基因芯片法，同時(shí)檢出GJB2、GJB3、SLC26A4和MT-RNR1基因上的九個(gè)熱點(diǎn)致病變異，具有大規(guī)模、快速和高通量等特點(diǎn)。受檢者人群的熱點(diǎn)致病變異總檢出率達(dá)5.62%(152/2705)，與江浙一帶報(bào)道的比較接近[10]。將ABR V波閾值高于30dB nHL定義為聽力損失組，發(fā)現(xiàn)聽力損失組的熱點(diǎn)致病變異檢出率24.14%(14/58)高于正常聽力組的5.21%(138/2647)，熱點(diǎn)致病變異被檢出者的聽力損失檢出率9.21%(14/152)高于未被檢出者的1.72%(44/2553)，說明致病熱點(diǎn)發(fā)生變異更容易發(fā)生聽力損失，即基因變異是新生兒聽力受損的一個(gè)重要因素。

表4 GJB2基因型的個(gè)例Table 4 GJB2 genotype case-by-case

表5 rs2274084和rs2274083的單體型分布(n=277)Table 5 Distribution of haplotype of rs2274084 and rs2274083(n=277)

表6 GJB3基因其他位點(diǎn)變異的最小等位基因頻率、基因型分布及組間頻率差異(n=46)Table6 TheMAF of other site variation in GJB3,distribution of genotypes and differences in genotype frequencies bet ween two groups(n=46)

表7 SLC26A4基因其他位點(diǎn)變異的最小等位基因頻率、基因型分布及組間頻率差異(n=75)Table 7 The MAF of other site variation in SLC26A4,distribution of genotypesand differences in genotype frequencies bet ween two groups(n=75)

在九個(gè)熱點(diǎn)致病變異中GJB2c.235del的檢出率最高，符合GJB2基因在各個(gè)民族和地區(qū)間的突變分布，東亞人群以c.235del最為多見，而白種人群和阿拉伯人群中則以c.35del為最常見[11]。本文未檢出GJB2c.35del，可能存在人種、地域等因素。SLC26A4c.919-2A＞G的檢出率其次，該剪切位點(diǎn)突變是中國前庭水管擴(kuò)大（EVA）患者中最常見的突變方式[11]，大前庭水管綜合征（LVAS）可從出生后至青春期這一年齡段內(nèi)任何時(shí)期開始起病，但多數(shù)為出生后幾年內(nèi)發(fā)病[12]。對(duì)SLC26A4基因突變者的定期隨訪，結(jié)合病史資料、顳骨CT或MRI的影像學(xué)檢查以及聽力學(xué)檢查，以期早發(fā)現(xiàn)早診斷。MT-RNR1基因致病變異[13-14]的檢出，明確了氨基糖苷類藥物敏感性個(gè)體。本文未檢出MT-RNR1m.1494C＞T，其產(chǎn)生的U-A堿基對(duì)與MT-RNR1m.1555A＞G產(chǎn)生的C-G堿基對(duì)在12SrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)上有相似的致病機(jī)制[13]，可能是地域、家族等因素使得某種選擇沒有被人群固定下來。近年來，隨著人們對(duì)藥物性致聾認(rèn)知的提高，無氨基糖苷類抗生素用藥史的敏感個(gè)體就不會(huì)導(dǎo)致耳聾，出生人口質(zhì)量得以提升，醫(yī)務(wù)工作者的積極宣傳，成為預(yù)防耳聾發(fā)生的有效手段。目前，在九個(gè)熱點(diǎn)致病變異中，僅發(fā)現(xiàn)GJB2176_191del和GJB2c.235del在聽力損失組中有更高的基因型頻率。純合或復(fù)合雜合是造成患者先天性聽力損失的主要病因，對(duì)單雜合者的隨訪和調(diào)查，可能將有因發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾所導(dǎo)致的基因型頻率分布的改變。由于本文所有受檢者的隨訪時(shí)間點(diǎn)并不完全一致，主要是追隨新生兒出生時(shí)間，因此，在比較組間基因型頻率時(shí)，部分受檢者尚未考慮到遲發(fā)性耳聾的因素。

測(cè)序技術(shù)是對(duì)微陣列芯片法的有效補(bǔ)充，在確保芯片結(jié)果準(zhǔn)確的同時(shí)，對(duì)測(cè)序結(jié)果有效地分析，還有助于發(fā)現(xiàn)其他位點(diǎn)變異，尤其是在聽力損失患者的耳聾相關(guān)基因中。針對(duì)Sanger測(cè)序法，可以用可監(jiān)測(cè)區(qū)域內(nèi)已檢出的變異位點(diǎn)總數(shù)/(可監(jiān)測(cè)區(qū)域序列總長度×檢測(cè)人數(shù))來衡量人群中的某一基因或某一區(qū)段是否容易發(fā)生變異。對(duì)前述的四個(gè)基因的可監(jiān)測(cè)區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，GJB2編碼序列和MT-RNR1基因的后段比較容易發(fā)生變異，而GJB2基因上發(fā)生可能致病或致病變異的風(fēng)險(xiǎn)更高。因此，在基于更廣泛人群的測(cè)序檢驗(yàn)或研究時(shí)，針對(duì)GJB2基因的分析是尋找耳聾成因較理想的選擇。

除熱點(diǎn)致病變異外，本文共檢出22個(gè)其他位點(diǎn)的變異。其中常見多態(tài)有GJB2c.79G＞A、GJB2c.341A＞G和GJB3c.357C＞T，遍布在聽力損失和正常聽力人群中，各基因型分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，關(guān)聯(lián)分析中rs2274084和rs2274083的單體型分布也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。GJB2c.109G＞A的MAF比較高，3名純合型均被確診為聽力損失，其左/右耳ABR反應(yīng)閾分別為40/60、40/30和50/40dB nHL，雜合型在聽力損失和正常聽力人群中都有分布，推測(cè)該變異可能屬于常染色體隱性遺傳，其基因型分布在兩組人群中有顯著差異。GJB2c.109G＞A與致病位點(diǎn)形成復(fù)合雜合的共有12名，其中8名是聽力損失患者，文獻(xiàn)報(bào)道c.109G＞A復(fù)合雜合相關(guān)的聽力損失程度多為輕中度[15]。

GJB2基因的c.257C＞G、c.282C＞T、c.283G＞A、c.427C＞T、c.478G＞A、c.508_511dup、c.559_604dup、c.571T＞C和c.598G＞A，以及SLC26A4c.919-18T＞G和MT-RNR1m.1557A＞C，這些變異的MAF＜1%，屬于少見變異。GJB2基因的c.368C＞A和c.608T＞C，以及MT-RNR1基因的 m.1382A＞C、m.1438A＞G、m.1442G＞A、m.1541G＞A和m.1598G＞A，這些變異的MAF在1%-3%左右，基于測(cè)序人數(shù)有限，本文將它們也歸于少見變異。其中MT-RNR1m.1438在人群中主要是以新生型等位為主。上述的18個(gè)少見變異中僅發(fā)現(xiàn)GJB2c.283G＞A和SLC26A4c.919-18T＞G的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，GJB2基因的 c.368C＞A 和 c.478G＞A，以及MT-RNR1基 因 的 m.1442G＞A、m.1541G＞A、m.1557A＞C和m.1598G＞A，這些僅在正常聽力組中被 檢 出 。GJB2基 因 的 c.282C＞T、c.283G＞A、c.427C＞T、c.508_511dup、c.559_604dup、c.571T＞C和c.598G＞A，以及SLC26A4c.919-18T＞G，這些僅在聽力損失組中被檢出。不過，由于多個(gè)少見變異的檢出人數(shù)僅1-2名，且都是僅在聽力損失組中檢出，統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差可能較大。今后隨著檢測(cè)樣本的逐漸增加，也考慮對(duì)病例組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行H-W平衡計(jì)算，以確保兩個(gè)組群都有代表性，這樣得到的結(jié)果可能會(huì)更趨于準(zhǔn)確。

表8 MT-RNR1基因其他位點(diǎn)變異的最小等位基因頻率、基因型分布及組間頻率差異(n=76)Table8 TheMAF of other site variations in MT-RNR1,distribution of genotypesand differences in genotype frequencies between two groups(n=76)

從MAF中可以得知各變異的稀有程度，結(jié)合不同表型人群中各變異的不同分布，探索疾病組中各變異的存在模式，為發(fā)現(xiàn)可能的致病病因找到依據(jù)。變異方式有同義變異、錯(cuò)義變異、無義變異、插入、缺失等，本文檢出的除c.282C＞T和c.357C＞T是同義變異外，多為錯(cuò)義變異，尤其是在GJB2基因上。生物信息學(xué)軟件提供了對(duì)錯(cuò)義變異所致氨基酸結(jié)構(gòu)改變的算法分析[16]，但在研究變異致病性的時(shí)候，更需要結(jié)合臨床實(shí)際的表型信息，還需要基于家系，了解變異的遺傳類型。本文僅單純地以ABRV波閾值高于30dBnHL劃分了聽力表型，并未細(xì)分到具體的聽力損失程度、類型和發(fā)生時(shí)間等，因此在細(xì)究單一位點(diǎn)變異與聽力損失表型關(guān)聯(lián)時(shí)，存在著分析的局限性，在評(píng)估變異致病性時(shí)，應(yīng)當(dāng)參考權(quán)威數(shù)據(jù)庫。本文從區(qū)域群體基因變異分布及差異的角度，試圖了解各位點(diǎn)變異在地區(qū)人群中的特點(diǎn)，在評(píng)估地區(qū)個(gè)體基因變異時(shí)給出更多的風(fēng)險(xiǎn)參考。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)倡導(dǎo)的是個(gè)體化服務(wù)，基于個(gè)體基因特征、生存環(huán)境及生活習(xí)慣，大范圍群體的數(shù)據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，最終都將被應(yīng)用在個(gè)體服務(wù)上。在評(píng)估個(gè)體表型時(shí)，基因變異可能僅僅只是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素。

1 王翠翠,袁慧軍.高通量測(cè)序技術(shù)在遺傳性耳聾研究中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].遺傳.2017,39(3):208-219.Wang CC,Yuan HJ.Application and progress of high-throughput sequencing technologies in the research of hereditary hearing loss[J].Hereditas(Beijing),2017,39(3):208-219.

2 代志瑤,戴樸.非綜合征型耳聾的基因型與表型關(guān)系[J].中華耳科學(xué)雜志.2013,11(1):151-155.Dai ZY,Dai P.Relationship between genotype and phenotype of nonsyndromic hearing loss[J].Chinese Journal of Otology,2013,11(1):151-155.

3 章雪芹,顧春麗,陳澄等.DPOAE+AABR聯(lián)合篩查在嬰兒聽力篩查中的應(yīng)用[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志.2016,4(24):397-399.Zhang XQ,Gu CL,Chen C,et al.The Combined Application of DPOAE and AABR to the Newborn Hearing Screening[J].Journal of Audiology and Speech Pathology,2016,4(24):397-399.

4 章雪芹,魏澄,王棟等.遺傳性耳聾基因篩查在新生兒聽力篩查中應(yīng)用研究[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志.2013,32(3):273-275.Zhang XQ,WeiC,Wang D,et al.Research on the significance of genetic deafness gene screening in neonatal hearing screen?ing[J].Chinese Journal of Practical Gynecology and Obstetrics,2013,32(3):273-275.

5 http://varnomen.hgvs.org/.

6 Richards S,AzizN,Bale S,et al.Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants:a joint consensus recommen?dation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology[J].Genetics inmedi?cin-e,2015,17(5):405-424.

7 Wu BL,Lindeman N,Lip V,et al.Effectiveness of sequencing con?nex in 26(GJB2)in cases of familial or sporadic childhood deaf?ness referred for molecular diagnostic testing[J].Genetics in Med?icine,2002,4:279-288.

8 Isamu Y,Akihiro O,Tatsuo M,et al.Identification of 605ins46,a novel GJB2mutation in a Japanese family[J].Auris Nasus larynx,2002,29(4):379-382.

9 韓冰,李倩,縱亮等.新生兒聽力及基因聯(lián)合篩查臨床實(shí)踐及篩查模式研究[J].中華耳科學(xué)雜志.2013,11(3):380-383.Han B,Li Q,Zhong L,et al.An Clinical Research on Newborn Hearing Concurrent Genetic Screening in 106,513 Neo?nates[J].Chinese Journal of Otology,2013,11(3):380-383.

10 章雪芹,李曉璐.我國不同地區(qū)新生兒聽力和耳聾基因聯(lián)合篩查的應(yīng)用與分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志.2016,24(7):11-12.Zhang XQ,LiXL.Application and analysis of combined screen?ing of neonatal hearing and deafness genes in different regions of China[J].Chinese Journal of Birth Health&Heredity,2016,24(7):11-12.

11 李磊,楊濤,吳皓.耳聾基因的篩查與診斷[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐.2010,9(5):409-412.Li L,Yang T,Wu H.Screening and diagnosis of deafness gene[J].Journal of Diagnostics Concepts&Practice,2010,9(5):409-412.

12 張宇,王幼勤,郭洪源等.聽力學(xué)表型在大前庭水管綜合征早期診斷中的意義[J].中華耳科學(xué)雜志.2016,14(1):57-62.Zang Y,Wang YQ,Guo HY.Significance of audiological pheno?types to early diagnosis of large vestibular aqueduct syn?drome[J].Chinese Journal of Otology,2016,14(1):57-62.

13 Zhao H,Li RH,Wang QJ,et al.Maternally Inherited Aminoglyco?side-Induced and Nonsyndromic Deafness Is Associated with the Novel C1494T Mutation in the Mitochondrial 12S rRNAGene in a Large Chinese Family[J].American Journal of Human Genetics,2004,74(1):139-152.

14 Zhu YH,Huang SS,Kang DY,et al.Analysis of the heteroplasmy level and transmitted features in hearing-loss pedigrees with mito?chondrial 12S rRNA A1555G mutation[J].BMCGenetics,2014,15(26):1-8.

15 Du YT,Huang LH,Cheng XH,et al.Analysis of p.V37I com?pound heterozygous mutations in the GJB2 gene in Chinese in?fants and young children[J].BioScience Trends,2016,10(3):220-226.

16 Yilmaz A.Bioin formatic Analysis of GJB2 Gene Missense Muta?tions[J].Cell Biochemistry and Biophysics, 2015, 71(3):1623-1642.

17 張晚霞,孫慧紅,馬麗霞等.30835例新生兒聽力和基因聯(lián)合篩查實(shí)踐研究[J].中華耳科學(xué)雜志.2016,14(6):769-773.Zhang WX,Sun HH,Ma LX,et al.Combined Hearing and Genet?ic Screening in 30835 Neonates[J].Chinese Journal of Otology,2016,14(6):769-773.

18 袁永一,戴樸.耳聾基因診斷——轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)推動(dòng)耳科學(xué)發(fā)展的范例[J].中華耳科學(xué)雜志.2014,12(1):1-5.Yuan YY,Dai P.Deafness Genetic Testing—an Example Transla?tional Medicine Accelerating the Progress of Otology[J].Chinese Journal of Otology,2014,12(1):1-5.