U-PLS/RBL三維熒光法測定藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量

劉 鐵，劉德龍，魏永巨

(河北師范大學 化學與材料科學學院，河北 石家莊 050024)

藤絡(luò)寧膠囊是由丁公藤、羌活、獨活、防己、延胡索、丹參等組成的復方制劑，具有疏風散寒、除濕通絡(luò)的功用，用于類風濕性關(guān)節(jié)炎屬寒濕瘀阻證[1]。而東莨菪內(nèi)酯作為處方中君藥丁公藤的主要有效成分之一,具有鎮(zhèn)痛及抗炎等作用[2-7],故測定其含量具有實際意義。目前，測定藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量的方法只有高效液相色譜法(HPLC)[8]。國標[1]中采用高效液相色譜梯度洗脫，分析過程耗時較長。

實驗研究表明，東莨菪內(nèi)酯有強熒光性質(zhì)，而熒光方法具有靈敏度高、測試簡單快速的優(yōu)點，但是若測試組分與共存組分的光譜重疊時選擇性較差，化學計量學中二階校正方法的“二階優(yōu)勢”可以彌補該缺點進行定量分析。解析三維熒光矩陣有效的二階校正方法主要包括平行因子分析法(PARAFAC)、三線性分解(ATLD)及其衍生方法(交替懲罰三線性分解法APTLD，自加權(quán)交替三線性分解法SWATLD)，以及基于潛變量的殘差雙線性分解的偏最小二乘法(包括Unfolded partial least squares coupled to residual bilinearization(U-PLS/RBL)和Multi-way partial least squares coupled to residual bilinearization(N-PLS/RBL))[9]。前兩類解析方法既能獲得分析體系的定性信息(激發(fā)光譜和發(fā)射光譜)，又能進行定量分析[10-12]，而基于潛變量的偏最小二乘法則只能獲得定量分析結(jié)果。但有一些文獻報道發(fā)現(xiàn)，U-PLS/RBL和N-PLS/RBL在解析組分之間或者組分與背景之間嚴重重疊及存在內(nèi)濾光效應等的復雜光譜體系時，能夠給出更好的定量分析結(jié)果[13-19]。目前尚未見利用二階校正方法U-PLS/RBL解析三維熒光測定藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量的報道。

本文首先研究了東莨菪內(nèi)酯的熒光性質(zhì)及最佳實驗條件，選擇最佳測定波長范圍后，用U-PLS/RBL解析合成樣確定了方法的可靠性，然后用于實際樣品藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的定量分析。為了驗證方法的可靠性，用HPLC方法進行了確證。

1 U-PLS/RBL算法原理

首先測定一系列校正樣和預測樣的三維熒光光譜矩陣，然后按照如下步驟進行計算。

第一步校正：即在校正樣的濃度和光譜數(shù)據(jù)之間建立PLS模型。先將測定的每個校正樣的三維熒光矩陣向量化(圖1左半部分)，即將每個三維熒光矩陣Xi(J,K)轉(zhuǎn)化為向量xi(J×K,1)，其中i=1，2，…，I,I為校正樣個數(shù)，J和K分別為激發(fā)和發(fā)射波長個數(shù)，之后將所有向量排成矩陣形式X(J×K,I)。然后用X(J×K,I)與校正樣中的濃度向量y(I× 1)進行PLS建模，得到兩個載荷矩陣P(JK×A)、W(JK×A)及回歸系數(shù)向量v(A× 1),A為利用基于去一法的交叉驗證法得到的潛因子數(shù)[20]。v用于估計待測樣中相應組分的濃度。

第二步預測：如果待測樣中不含其它未知成分，則按照如下公式準確估計待測樣中相應組分的濃度。

(1)

tu=(WTP)-1WTvec(Xu)

(2)

其中，tu為待測樣向潛變量空間的投影得分向量，vec(Xu)為待測樣矩陣的向量化形式。

如果待測樣中含有其它未知成分，由式(2)計算的tu不適合計算待測樣中的組分濃度，表現(xiàn)為PLS預測殘差遠大于儀器噪聲。此時按照基于主成分分析的殘差雙線性分解法(RBL)對背景信號進行扣除[9]，公式為(圖1右半部分)：

Xu=reshape(PtRBL)+BRBLTRBLT+ERBL

(3)

上式說明樣本數(shù)據(jù)由兩部分構(gòu)成，一部分為校正樣組分的信號，另一部分則來自試樣中某些潛在的干擾組分。reshape表示將向量轉(zhuǎn)化為矩陣，ERBL表示誤差矩陣，BRBLTRBLT表示對殘差矩陣(Xu-reshape(PtRBL))進行主成分分析后的矩陣乘積(主成分數(shù)=Nunx)。

對式(3)中ERBL的模進行極小化(P保持不變，只改變tRBL)，得到最佳的tRBL，將tRBL代入式(1)可得到扣除背景信號后的真實濃度。詳細的原理和算法見文獻[9]。U-PLS/RBL解析過程如圖1所示[9]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(日本日立公司，用1 cm石英比色皿掃描激發(fā)-發(fā)射三維熒光光譜)；激發(fā)波長：310～420 nm，發(fā)射波長：400～550 nm。狹縫寬度為5.0/5.0 nm，掃描速度為1 200 nm/min。

安捷倫1260高效液相色譜儀(配FLD檢測器)；分析天平(0.000 01 g)；pH酸度計(美國Orion公司，Orion868)。

圖1 U-PLS/RBL解析過程Fig.1 Scheme illustrating how U-PLS/RBL works for second-order data three typical calibration samples(of a possibly much larger calibration set) are shown at the left,from which the unfolding operation leads to the XPLS calibration data matrix；the latter is processed with U-PLS and submitted,together with the test sample data X test,to RBL for separating the contribution of the potential interferents,yielding accurate analyte prediction

東莨菪內(nèi)酯(上海源葉生物科技有限公司)：精確稱取1.39 mg東莨菪內(nèi)酯標準品，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配成55.6 mg/L的操作液，在4 ℃冰箱避光保存。

藤絡(luò)寧膠囊(購于上海天貓國大藥房旗艦店，生產(chǎn)廠家：吉林省通化博祥藥業(yè)股份有限公司)：取出藤絡(luò)寧膠囊內(nèi)的藥粉，準確稱取0.980 0 g。甲醇浸泡超聲1 h后，搖勻、過濾，并將濾液轉(zhuǎn)至50 mL棕色容量瓶，用甲醇定容，得到19.6 g/L的操作液，置于冰箱4 ℃避光保存。

甲醇(色譜純)；磷酸(分析純)；BR緩沖溶液(0.4 mol/L，pH 9.0)；實驗所用其他試劑均為分析純，實驗用水為自制二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1合成樣的測定取一系列10 mL容量瓶，加入2.00 mL BR緩沖溶液、東莨菪內(nèi)酯溶液和一定量的甲醇，用二次蒸餾水定容后混合均勻。其中7個校正集溶液東莨菪內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.014 7、0.029 4、0.044 1、0.058 8、0.073 5、0.088 2、0.102 9 mg/L；配制6個確證樣，其中東莨菪內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.022 05、0.036 75、0.051 45、0.066 15、0.080 85、0.095 55 mg/L。

2.2.2藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量的測定取一系列10 mL容量瓶，加入2.00 mL BR緩沖溶液、東莨菪內(nèi)酯以及適量藤絡(luò)寧膠囊提取液，用二次蒸餾水定容后混合均勻，進行三維熒光掃描。

其中1～7號為校正集，校正樣中東莨菪內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為0.014 7、0.029 4、0.044 1、0.058 8、0.073 5、0.088 2、0.102 9 mg/L。8～12號為樣品集，其中含有一定濃度的藤絡(luò)寧膠囊提取液。

2.2.3回收率實驗1～7號為校正集，濃度同上。8～12號為只有藤絡(luò)寧提取液的樣品。13～17號瓶在藤絡(luò)寧膠囊提取液基礎(chǔ)上，再加入一定量的東莨菪內(nèi)酯標準品。

2.2.4色譜法測定實驗安捷倫1260高效液相色譜儀，F(xiàn)LD檢測器。以ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱,流動相為甲醇-水(含0.2%磷酸)(30∶70，體積比),柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為：激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長460 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 東莨菪內(nèi)酯的熒光光譜性質(zhì)與影響因素

圖2A為東莨菪內(nèi)酯的三維熒光等高線圖，可知東莨菪內(nèi)酯的最大激發(fā)波長為375 nm，最大發(fā)射波長為460 nm。圖2B為藤絡(luò)寧膠囊的三維熒光等高線圖，可知除了東莨菪內(nèi)酯的光譜外，藤絡(luò)寧膠囊的基體成分在此波長范圍內(nèi)含有與之嚴重重疊的高強度光譜信號，利用普通熒光法難于準確測定。故本文應用二階校正U-PLS/RBL方法解析三維熒光光譜，以“數(shù)學分離”代替“化學分離”。

為了獲得穩(wěn)定和準確的分析結(jié)果，考察了溶液條件對光譜的影響。實驗結(jié)果表明，東莨菪內(nèi)酯在pH 7.83～11.53范圍內(nèi)熒光強度高且穩(wěn)定，因此實驗選取pH 9.0為最佳酸度條件。甲醇用量在0.1%～10%范圍基本無影響，實驗選擇甲醇用量低于10%。實驗結(jié)果表明，東莨菪內(nèi)酯的質(zhì)量濃度在0.014 7～0.102 9 mg/L范圍內(nèi)與熒光強度呈線性關(guān)系。

Nominal(mg/L)Predicted(mg/L)Recovery(%)0 022050 0215697 80 036750 0331290 10 051450 0490595 30 066150 06787102 60 080850 08385103 70 095550 09704101 6Meanrecovery(%)98 5

3.2 合成樣的濃度解析

利用校正樣進行U-PLS/RBL建模后，可對合成樣進行定量分析，來驗證方法的可靠性。表1為U-PLS/RBL對合成樣中東莨菪內(nèi)酯的定量解析結(jié)果。計算得平均回收率為98.5%，說明方法可靠。

3.3 U-PLS/RBL法解析藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯含量與回收率

應用U-PLS/RBL首先需確定模型中的主因子數(shù)，圖3為去一法得到的U-PLS/RBL的交叉驗證CV圖及真實濃度與預測濃度的關(guān)系曲線。從圖3可知，對于東莨菪內(nèi)酯的最佳因子數(shù)為1，關(guān)系曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998，說明體系中只有1個熒光信號，這與實際情況一致。U-PLS/RBL的第二步是確定待測樣中的干擾組分數(shù)，考察了U-PLS/RBL估計的光譜殘差與背景組分數(shù)的變化情況，當Nunx=0時，即假定沒有干擾背景，殘差約為700，遠大于儀器本身的噪音，說明體系中含有未知干擾組分。當背景組分≥1時，殘差強度很低且接近儀器噪音，所以確定背景組分數(shù)Nunx=1。

然后利用RBL估計背景組分的激發(fā)和發(fā)射光譜，即對殘差矩陣(Xu-reshape(PtRBL))進行主成分分析BRBLTRBLT后，取BRBL和TRBL矩陣的第一列。

在確定最佳因子數(shù)和背景因子數(shù)后，計算出扣除背景干擾后的藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的平均含量為0.058 9%(表2)。以色譜法測定值為標準，計算得U-PLS/RBL法解析東莨菪內(nèi)酯的相對誤差為3.16%，說明本方法準確。

No．ConcentrationofTengluoningcapsule(mg/L)Predictedconcentrationofscopoletin(mg/L)Contentofscopoletin(%)P158 80 034400 0585P258 80 035040 0596P358 80 034090 0580P458 80 034180 0581P558 80 035470 0603Averagecontent(%)--0 0589Relativeerrors(%)?--3 16

*the relative errors were obtained by comparing the content calculated by U-PLS/RBL with the result determined by HPLC method

用U-PLS/RBL法解析得到藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的平均回收率為100.4%，說明本方法的結(jié)果可靠。

圖4 東莨菪內(nèi)酯(a)和藤絡(luò)寧膠囊(b)的HPLC圖Fig. 4 Liquid chromatograms of scopoletin(a)and Tengluoning capsule sample(b)a： 4 μL scopoletin solution(55.6 mg/L)；b ：5 μL Tengluoning capsule solution(19.6 g/L)

3.4 高效液相色譜法驗證

在選定的最佳條件下，東莨菪內(nèi)酯的保留時間為8.7 min左右(圖4a)。以保留時間8.7 min的峰面積積分值(Y)為縱坐標,東莨菪內(nèi)酯進樣量(X,μg)為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程：Y=102.8+1.735×104X，r=0.999 8，說明東莨菪內(nèi)酯在0.029 4～0.147 μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密吸取對照品溶液4 μL與藤絡(luò)寧膠囊樣品溶液5 μL,注入高效液相色譜儀,依上述色譜條件進行分離(圖4b),外標法計算含量。在東莨菪內(nèi)酯的保留時間8.7 min處，根據(jù)回歸方程計算得到藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的平均含量為0.057 1%(n=5,RSD=1.5%)。這與U-PLS/RBL熒光方法測得結(jié)果0.058 9%一致，證明了二階校正方法的可靠性。

4 結(jié) 論

本文借助于熒光光譜的高靈敏性及化學計量學二階校正方法的高選擇性，成功地測定了藤絡(luò)寧膠囊中東莨菪內(nèi)酯的含量，與色譜法相比，本方法操作簡便，綠色環(huán)保且費用較低，適合復方中藥體系中有效成分含量的測定，是一種有應用潛力的方法。

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