豬源水獺漫游球菌的鑒定與耐藥性分析

朱天倫 ， 王果帥 ， 徐 磊 ， 陶 婭 ， 楊躍飛 ， 王彥紅

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009 ；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009)

2016年12月24日，從揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收到的送檢20日齡病死豬中分離得到1株疑似水獺漫游球菌的革蘭陽性球菌，經(jīng)分離鑒定，確認(rèn)為水獺漫游球菌。由于水獺漫游球菌能引起人類感染，本研究對(duì)臨床中采集到的水獺漫游球菌的藥敏、生化等特性做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2016年12月24日在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收到送檢的20日齡病死豬。主訴：飼養(yǎng)170頭，5日齡開始發(fā)病，皮膚發(fā)紅，無拉稀，無呼吸道癥狀。病理變化為皮膚點(diǎn)狀出血，內(nèi)臟無明顯病變。無菌采集病死豬皮膚以及心、肝、脾、肺、腎等組織臟器。

1.2 主要試劑 用市售的普通綿羊血和普通營養(yǎng)瓊脂粉按常規(guī)方法配制成血瓊脂平板，按常規(guī)方法配制的麥康凱瓊脂平板；購自杭州天和微生物試劑有限公司的生化培養(yǎng)管和藥敏試紙。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 采集病死豬的心、肝、脾、肺等組織器官，按常規(guī)無菌操作接種于血瓊脂平板上，置37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑選疑似單菌落分別在麥康凱培養(yǎng)基與綿羊血培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。觀察純化菌的生長狀況和形態(tài)特征。

1.3.2 16S rRNA 根據(jù)文獻(xiàn)方法[1]制備細(xì)菌基因組RNA模板，按照16S rRNA Bacterial Identification PCR Kit方法操作，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，將目的片段切膠后送至金斯瑞生物科技公司進(jìn)行測序。

1.3.3 生化試驗(yàn) 用接種針挑取純化后的細(xì)菌單個(gè)菌落，分別接種于硫化氫、蔗糖、甘露醇、半乳糖、ONPG、山梨醇、木糖醇、尿素、硝酸鹽還原、乙酰葡萄糖胺、甘露糖、麥芽糖、精氨酸、蜜二糖、乳糖、蕈糖、V-R、M.R.、木糖對(duì)照生化管內(nèi)反應(yīng)，置37 ℃條件培養(yǎng)24 h，按生化反應(yīng)管說明書進(jìn)行判斷。

1.3.4 小鼠毒力試驗(yàn) 將培養(yǎng)于血瓊脂平板上的細(xì)菌用生理鹽水溶解后，采用腹腔注射的方式注射菌液，設(shè)置陰性對(duì)照組給小鼠腹腔注射生理鹽水。24～48 h后觀察小鼠狀況并進(jìn)行剖檢。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 采用Kirby-Bauer藥敏紙片的方法，采用頭孢曲松、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西環(huán)素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和妥布霉素這15種藥敏紙片，在無菌條件下，挑取純化后的菌株，在綿羊血培養(yǎng)基涂布均勻，取藥敏紙片貼于平板瓊脂面上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，測量出各抗生素紙片的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 經(jīng)分離純化，從病死豬的心血分離出病料接種于血瓊脂平板培養(yǎng)24 h后生長良好，形成光滑型菌落，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長。

2.2 16S rRNA的PCR擴(kuò)增及序列分析 分離菌的16S rRNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，出現(xiàn)500 bp左右的目的條帶，將所測定的序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，結(jié)果表明，所獲得的序列與已公布的水獺漫游球菌(序列號(hào)：DQ395281)的同源性高達(dá)100%。

2.3 生化試驗(yàn)鑒定 細(xì)菌接種于微量生化反應(yīng)管內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h，鑒定結(jié)果符合水獺漫游球菌的生化特性。生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果見表1。

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果

注: 在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，+表示產(chǎn)酸，-表示不產(chǎn)酸。在其他生化試驗(yàn)中，+表示陽性，-表示陰性

2.4 小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果 注射菌液48 h后，試驗(yàn)組小鼠精神狀況良好。采用頸椎脫臼法處死小鼠，剖檢，器官并無明顯病變。無菌采取小鼠肝臟制觸片，進(jìn)行革蘭染色，未觀察到球菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株對(duì)美洛西林有較高的敏感性；對(duì)丁胺卡那霉素與多粘菌素B有較低敏感性；對(duì)頭孢曲松、氟苯尼考、多西環(huán)素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和妥布霉素不敏感。

3 討論

1989年Collins等報(bào)道了漫游球菌屬,當(dāng)時(shí)只發(fā)現(xiàn)了1個(gè)種，為河流漫游球菌[2]，截止至2014年，共發(fā)現(xiàn)8個(gè)種[3]。文獻(xiàn)[4]報(bào)道了在2005年前發(fā)現(xiàn)的5種漫游球菌，分別為1989年發(fā)現(xiàn)的河流漫游球菌[2](Vagococcusfluvialis)，1990年發(fā)現(xiàn)的鮭魚漫游球菌[5](Vagococcussalmoninarum)，1999年發(fā)現(xiàn)的水獺漫游球菌[6](Vagococcuslutrae)，2000發(fā)現(xiàn)的海豹漫游球菌[7](Vagococcusfessus)和2004年發(fā)現(xiàn)的嗜肉漫游球菌[8](Vagococcuscarniphilus)，其余為Vagococcuselongatus[9](2007)，Vagococcuspenaei[10](2009)和Vagococcusacidifermentans[11](2010)。水獺漫游球菌(Vagococcuslutrae)在1999年由Lawson等從普通水獺皮中分離而來[6]。2015年在法國馬賽市發(fā)現(xiàn)一例由于水獺漫游球菌引起的人類感染，推測感染為食物介導(dǎo)，而此前水獺漫游球菌從未被報(bào)道為人類病原體[12]。

水獺漫游球菌是單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列的革蘭陽性球菌，無芽孢，無動(dòng)力，兼性厭氧,觸酶陰性[2]。水獺漫游球菌感染會(huì)引起嚴(yán)重的皮膚病變，2015年法國馬賽市的水獺漫游球菌人類感染病例，發(fā)現(xiàn)時(shí)患病已臥床4月，皮膚損害嚴(yán)重，主要通過阿莫西林治療感染,15日后痊愈。從以上人類感染的病例推測，感染源是由食物介導(dǎo)，由于衛(wèi)生條件差，細(xì)菌跟隨直接排放到床上的糞便一同排出，患者皮膚與之直接接觸后感染[12]，并非由于腸道直接吸收感染。本試驗(yàn)中分離到的水獺漫游球菌的來源是20日齡死亡的仔豬，從小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果來看，該菌毒性較弱，并未能引起小鼠死亡，甚至組織器官的明顯病變。因此，推測該菌感染并非引起仔豬死亡的直接原因。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看，水獺漫游球菌對(duì)美洛西林有較高敏感性。美洛西林屬于青霉素類抗生素，同時(shí)上述人類感染病例治療中使用的阿莫西林也屬于青霉素類抗生素，由此可見，該菌對(duì)青霉素類抗生素有較高的敏感性，因此青霉素類抗生素可作為該菌感染治療的首選藥物。文獻(xiàn)[11]中描述該菌對(duì)頭孢曲松、慶大霉素、紅霉素等一些廣譜類抗生素均敏感，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)廣譜類及大多氨基糖苷類抗生素都有較強(qiáng)的耐藥性，推測該菌在傳播過程中已產(chǎn)生交叉耐藥。因此在抗生素的選擇使用中應(yīng)嚴(yán)格遵守抗生素使用原則，避免細(xì)菌產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥性。

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