改良胰管逆行注射法制犬急性壞死性胰腺炎模型

薛新梅， 魯夢(mèng)婷， 魏 娜， 林德貴

(1.新疆巴音郭楞蒙古自治州州動(dòng)物疾病控制與診斷中心 ， 新疆 巴音郭楞 841000； 2.西班牙海博萊生物大藥廠股份公司北京代表處 ， 北京 海淀 100086； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

急性胰腺炎(AP)是消化科的常見危急重癥，發(fā)病初期血液中產(chǎn)生的大量抗炎細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及氧自由基，炎癥介質(zhì)之間相互作用，引起“炎癥介質(zhì)瀑布樣級(jí)聯(lián)效應(yīng)”[1-3]。臨床上可分為輕癥急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎，重癥急性胰腺炎患犬的病死率較高，可達(dá)20%～30%[4]。臨床以急性腹痛、嘔吐、發(fā)熱、血與尿淀粉酶增高為特點(diǎn)。急性胰腺炎又分水腫型和出血壞死型兩種，而臨床上多見水腫型[5]。急性胰腺炎由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、臨床表現(xiàn)多樣、病死率高，因此動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)在研究中運(yùn)用廣泛。從1856年第一個(gè)急性胰腺炎動(dòng)物模型制作出來(lái)后，多種動(dòng)物模型相繼問(wèn)世。大致可分為非侵入型(雨蛙素誘導(dǎo)法、L-精氨酸誘發(fā)法、無(wú)膽鹽乙硫氨酸飼喂法等)和侵入型(結(jié)扎法、胰管逆行注射法等)。每種方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同有所選擇。胰管逆行注射法制胰腺炎操作復(fù)雜、易于感染、易形成不全梗阻，但存活率相對(duì)較高，模型最為穩(wěn)定，是目前最常用的、最被認(rèn)可的模型。本研究證實(shí)了用5%?；悄懰徕c(0.1 mL/kg體重)和胰蛋白酶(3 500 U/kg體重)的混合溶液，通過(guò)改良后的胰管逆行注射法，能成功構(gòu)建犬急性壞死性胰腺炎，且模型相對(duì)穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自北京市沙河利通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心的雜種健康犬6只，體重9±3 kg體重，年齡1～3歲，雌雄各半，所有動(dòng)物按照標(biāo)準(zhǔn)免疫與驅(qū)蟲程序進(jìn)行防疫(六聯(lián)苗、狂犬苗，荷蘭英特威國(guó)際有限公司；汽巴杜蟲丸，諾華動(dòng)物保健公司)。實(shí)驗(yàn)犬飼養(yǎng)在相對(duì)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，有通風(fēng)設(shè)施，室溫在18 ℃～25 ℃之間，每日飼喂1次。試驗(yàn)開始前一天做生化血常規(guī)，正常者入選。

1.2 犬實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎模型構(gòu)建 術(shù)前所有犬禁食24 h，正常飲水。肌肉注射舒泰50?(0.05 mL/kg體重)和846合劑(0.05 mL/kg體重)進(jìn)行麻醉，待犬進(jìn)入麻醉后，行常規(guī)剃毛手術(shù)準(zhǔn)備，鋪創(chuàng)巾。腹中線切口開腹，暴露十二指腸向后翻轉(zhuǎn)，顯示胰腺，緊貼十二指腸腸壁，呈粉紅色、質(zhì)軟，呈扁平長(zhǎng)帶狀(胰腺大小個(gè)體差異較大)。尋找胰腺右葉與十二指腸連接處，在其對(duì)側(cè)腸壁切開長(zhǎng)約2.0～2.5 cm的縱行切口，即可見到粉紅色腸壁一個(gè)大小約1.0～1.5 mm略發(fā)白的臍樣凹陷，這即為小乳頭(副胰管開口于此)，在小乳頭上方大約1.5～3 cm處可見向腸腔突出的大小約3～4 mm的隆起為大乳頭(膽總管和胰管開口于此)，結(jié)扎胰管。在副胰管處向乳頭部置入直徑2.0 mm左右的塑料管材料，深度約1～1.5 cm，將微量注射泵連于管外，以8 Kpa的恒定壓力將5%牛磺膽酸鈉(0.1 mL/kg體重)和胰蛋白酶(3 500 U/kg體重)的混合液以27 mL/h的速度注入胰管內(nèi)，留置 5 min后將塑料管拔出。縫合十二指腸壁，并逐層關(guān)腹。整個(gè)過(guò)程無(wú)菌操作。手術(shù)室環(huán)境溫度控制在25 ℃±1 ℃。造模后7 d實(shí)驗(yàn)犬禁食禁水。

模型構(gòu)建完成后0.5 h開始靜脈滴注，之后每天8∶00和20∶00給實(shí)驗(yàn)犬輸液，直到7 d后實(shí)施安樂(lè)死。每天按照0.1 mL/kg體重的劑量，皮下注射拜有利。

1.3 樣品的采集及處理 實(shí)驗(yàn)犬在麻醉前，造模后0.5 h，造模后12 h，24 h，分別在每天第1次輸液前采集靜脈血，做血常規(guī)檢驗(yàn)及生化指標(biāo)檢測(cè)；在造模前以及在實(shí)驗(yàn)后48 h及第7天應(yīng)用B超檢測(cè)胰腺在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所用數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 4 Project統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性胰腺炎模型構(gòu)建情況 向主胰管內(nèi)注入?；悄懰徕c和胰蛋白酶復(fù)合液15 min后可以看到胰腺充血、出血明顯(見中插彩版圖1)；造模后1 d，患犬體溫升高，嘔吐，拉血紅色稀便，腹痛，呈“祈禱”式(見中插彩版圖2、3)；在模型構(gòu)建完成第1天，各模型組與造模前相比，血漿淀粉酶含量差異極顯著(P<0.01)，達(dá)到術(shù)前5倍以上(表1)，血清脂肪酶含量也達(dá)到術(shù)前8倍左右，差異極顯著(P<0.01)(表1)；在模型構(gòu)建完成48 h，各模型組與造模前相比，B超影像顯示胰腺邊緣不規(guī)則增大，回聲增強(qiáng)且不均質(zhì)，包膜不可見；圍繞胰腺的腸系膜回聲增強(qiáng)，水腫導(dǎo)致低回聲的均一的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中有產(chǎn)回聲的小葉組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；有些犬出現(xiàn)少量腹水(圖4～6)。

圖4 胰腺縱切面

圖5 胰腺縱切面

圖6 腎臟部位超查出少量腹水

光鏡下觀察可見造模的實(shí)驗(yàn)犬胰腺，腺泡細(xì)胞細(xì)胞崩解、壞死，細(xì)胞界限不分明(見中插彩版圖7)。以上結(jié)果表明，采用胰管逆行注射法構(gòu)建急性胰腺炎模型成功，各模型組均構(gòu)建成功說(shuō)明了胰管逆行注射法構(gòu)建的急性胰腺炎模型穩(wěn)定。

表1 實(shí)驗(yàn)犬術(shù)前與術(shù)后12 h血清淀粉酶和脂肪酶水平對(duì)比 (U/L)

**:術(shù)前與術(shù)后12 h差異極顯著(P<0.01)

2.2 實(shí)驗(yàn)犬血液學(xué)檢測(cè) 白細(xì)胞總數(shù)、血清淀粉酶、血清脂肪酶變化(見表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)犬白細(xì)胞總數(shù)、淀粉酶和脂肪酶變化情況

**：術(shù)前與術(shù)后差異極顯著(P<0.01)

血清淀粉酶和血清脂肪酶的含量是檢測(cè)急性胰腺炎的一個(gè)重要生化指標(biāo)：(1)從表2可以看出，實(shí)驗(yàn)犬在術(shù)后的第1天到第3天的淀粉酶、脂肪酶含量變化差異顯著(P<0.05)，表明所有模型組的胰腺炎病理模型構(gòu)建成功；(2)從淀粉酶變化圖(圖9)可以看出，急性胰腺炎發(fā)生之后，其血清淀粉酶含量是一個(gè)先升高后下降的變化過(guò)程，在第1天就可以達(dá)到峰值，其數(shù)值變化升高8倍左右，在第3天到第4天之間緩慢下降，于第7天下降到接近正常值水平；(3)從表2可以看出，術(shù)后的第1天到第3天的脂肪酶含量變化差異顯著(P<0.05)，表明所有模型組的胰腺炎病理模型構(gòu)建成功；(4)從脂肪酶變化圖(圖9)可以看出，急性胰腺炎發(fā)生之后，其血清脂肪酶含量是一個(gè)先升高后下降的變化過(guò)程，在第一天就可以達(dá)到峰值，其數(shù)值變化升高10倍左右，在第2天到第4天之間緩慢下降，于第7天下降到接近正常值水平。

2.3 B超影像學(xué)觀察 造模前，使用高頻探頭進(jìn)行十二指腸段縱向定位掃查，可見正常胰腺右葉質(zhì)地均勻，邊緣清晰的胰腺，胰腺呈細(xì)粒狀低回聲，回聲均勻(圖8)。造模后2 d， 胰腺右葉包膜不可見，邊緣不規(guī)則增大，實(shí)質(zhì)回聲顯著不均(如圖9)。造模后7 d，胰腺邊緣分界不清、水腫，實(shí)質(zhì)回聲不均勻，有低回聲甚至無(wú)回聲區(qū)，也有強(qiáng)回聲區(qū)并伴有后方聲影，提示有局部壞死灶(如圖10)。

圖8 胰腺縱切面

圖9 胰腺縱切面

圖10 胰腺縱切面

3 討論

利用動(dòng)物模型來(lái)研究急性胰腺炎的發(fā)展最早可以追溯到1859年，Bernad用膽汁和橄欖油注入雜種犬的胰管內(nèi)造成了急性胰腺炎。在此之后，通過(guò)不斷的探索，成功地復(fù)制出了多種不同類型的急性胰腺炎動(dòng)物模型，如雨蛙素誘發(fā)法、L—精氨酸誘發(fā)法、膽胰管逆行注射法和膽胰管結(jié)扎法等。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不一樣，選擇合適的造模方式也是不一樣的。

目前，誘發(fā)犬急性胰腺炎模型較常用的方法是膽胰管結(jié)扎法、膽胰管逆行注射法等。相對(duì)而言膽胰管結(jié)扎法成本低，但模型穩(wěn)定性不高，不能控制急性胰腺炎造模的程度；膽胰管逆行注射法操作較復(fù)雜，但模型最穩(wěn)定，也是目前最常用的而且最認(rèn)可的造模方式。

本試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)多種造模方式進(jìn)行摸索發(fā)現(xiàn)，膽胰管結(jié)扎法易造成膽汁淤積，在造成胰腺的損傷的同時(shí)，還能造成肝臟的嚴(yán)重?fù)p傷。這樣不僅影響了生化指標(biāo)的變化，還影響觀察胰腺炎的發(fā)生發(fā)展，不能體現(xiàn)出胰腺炎繼發(fā)肝臟的損傷。若改良使用胰管結(jié)扎法，由于胰管和總膽管共同開于十二指腸壺腹部，在十二指腸壁有一個(gè)公共通道，不易于胰管的單獨(dú)結(jié)扎。而且，在單純胰管結(jié)扎造成的胰腺炎模型中，由于犬個(gè)體差異，造出的急性胰腺炎模型也不穩(wěn)定，經(jīng)病理組織學(xué)觀察，有的間質(zhì)充血、水腫顯著，出血不顯著，表現(xiàn)出的是輕度水腫型胰腺炎；有的可見局灶性壞死，伴發(fā)出血，表現(xiàn)出的是重度壞死型胰腺炎。

有試驗(yàn)表明[6]，胰酶釋放入間質(zhì)內(nèi)有3種機(jī)制：(1)機(jī)械性或功能性的胰管系統(tǒng)閉塞使胰酶排出受阻；(2)細(xì)胞毒性因子(或物質(zhì))導(dǎo)致腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的質(zhì)膜完整性遭到破壞；(3)血管因素或溶酶體的影響而導(dǎo)致腺泡細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的酶原活性早熟。采用胰管逆行注射法造急性胰腺炎模型，常采用?；悄懰徕c和胰蛋白酶混合液通過(guò)胰管注入胰腺。由于異常的胰酶激活能導(dǎo)致胰腺自身消化，而牛磺膽酸鈉則是一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，注入后能激活胰蛋白酶原，最終導(dǎo)致胰腺組織的損傷，啟動(dòng)胰腺自身的消化鏈鎖。?；悄懰徕c誘導(dǎo)胰腺損傷的程度與濃度有關(guān)。試驗(yàn)證明，逆行膽胰管注射誘發(fā)的急性胰腺炎模型中，5%?；悄懰徕c造成的胰腺病變明顯比3%牛磺膽酸鈉誘發(fā)的嚴(yán)重[7]。

本試驗(yàn)通過(guò)臨床癥狀、生化指標(biāo)、B超影像學(xué)觀察和病理學(xué)變化表明，在傳統(tǒng)胰管逆行注射法的基礎(chǔ)上，通過(guò)改良結(jié)扎主胰管后，再用5%?；悄懰徕c(0.1 mL/kg體重)和胰蛋白酶(3 500 U/kg體重)的混合液以27 mL/h的速度注入副胰管內(nèi)，保證混合物以恒定壓強(qiáng)注入胰腺中。造出的實(shí)驗(yàn)犬急性胰腺炎模型穩(wěn)定，均是急性壞死性胰腺炎；模型死亡率低。結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備急性壞死性胰腺炎模型的方法是成功的，為進(jìn)一步研究和探討ASP的臨床治療和基礎(chǔ)損傷機(jī)制提供了一種較為理想的實(shí)驗(yàn)手段。

參考文獻(xiàn):

[1] Lankisch P G，Apte M，Banks P A．Acute pancreatitis[J]． Lancet，2015，386(9988) ：85-96．

[2] Mews P，Philips P，F(xiàn)ahmy R，etal．Pancreatic stellate cells respond to inflammatory cytokines：potential role in chronic pancreatitis[J]．Gut，2002，50(4) ：535-541．

[3] 劉大晟，吳先林，李接興，等．三種不同造模方法建立大鼠記性胰腺炎模型的對(duì)比[J]．中國(guó)老年學(xué)，2016，36(10)：2 315-2 318.

[4] 下瀨川澈．急性胰腺炎重癥化的機(jī)序[J]．日消志，2001，98：1 029-1 036．

[5] 王建華．家畜內(nèi)科學(xué)[M]．3版.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：369-372．

[6] Evander A，Lundgulist I．Influence of hormonal stimulation by cerulein on acute experiment pancreatitis in the rat[J]．Eur Surg Res，1981，13：857．

[7] Robert J，Greenstein M D，Lawrence R，etal．Activation of the renin systern in acute pancreatitis[J]．Am J Med，1997，82(3)：401-404．