新城疫病毒致雞胚成纖維細(xì)胞病變特性研究

張桂枝 ， 靳雙星

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046)

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起家禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，具有很高的發(fā)病率和死亡率，是危害養(yǎng)禽生產(chǎn)的一種重要傳染病，OIE將其列為A類疫病。新城疫病毒具有血凝素、神經(jīng)氨酸酶和溶血素。近年來研究發(fā)現(xiàn)NDV感染后，可導(dǎo)致組織損傷、細(xì)胞病變、細(xì)胞融合、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡等[1-2]。雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和分子生物學(xué)等許多方面的研究。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，NDV存在很多變異株，不同毒株毒力差異較大，強(qiáng)毒株可在體外多種細(xì)胞中增殖，通過膜融合而感染宿主細(xì)胞[3]，而弱毒株只有在含有胰蛋白酶的細(xì)胞中才能增殖[4]。本研究通過新城疫Ⅰ系毒株和新城疫Ⅳ系毒株在CEF上增殖，以觀察病毒感染所致的細(xì)胞病變(CPE)和致病性的差異，旨在評(píng)價(jià)NDV對(duì)CEF的易感性，為NDV的分離鑒定、增殖及中藥提取物體外抗病毒效果研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試雞胚9～11日齡SPF雞胚由河南后羿生物工程有限公司提供。新城疫Ⅰ系疫苗、新城疫Ⅳ系疫苗由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。經(jīng)SPF雞胚絨毛尿囊腔接種復(fù)壯，48 h收集病毒液，測(cè)定新城疫Ⅰ系毒株、新城疫Ⅳ系毒株的血凝(HA)效價(jià)分別為28和27，-20 ℃保存?zhèn)溆?。主要儀器設(shè)備:細(xì)胞培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)等。主要試劑:DMEM培養(yǎng)液(GIBCO)、新生牛血清(GIBCO)、胰蛋白酶(Invitrogen)等。

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細(xì)胞單層制備 無菌取出9～11日齡雞胚，剪去胚頭、爪、翅和內(nèi)臟，用含有雙抗(青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL)Hank's液反復(fù)沖洗2～3次，剪成1 mm3大小碎塊，用0.25%胰蛋白酶消化組織塊20 min，然后傾去上層胰酶并用Hank's液洗滌2～3次，用含5%新生牛血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，8層無菌紗布過濾，制成1×106/mL的CEF細(xì)胞懸液，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.2 mL/孔，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層，備用[5]。

1.2.2 雞胚成纖維細(xì)胞接種病毒及細(xì)胞形態(tài)觀察 CEF形成單層后，吸出培養(yǎng)液，用Hank's液反復(fù)沖洗2～3次，添加用維持液(含1%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液)稀釋的稀釋度分別為10-1～10-11病毒液0.1 mL/孔；設(shè)為4個(gè)試驗(yàn)組，分別為新城疫Ⅳ系毒株組、新城疫Ⅰ系毒株組、新城疫Ⅳ系毒株胰酶組和新城疫Ⅰ系毒株胰酶組(胰蛋白酶含量均為25 μg/mL)，另設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照(維持液0.2 mL/孔)。試驗(yàn)組在37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，棄去病毒液，加入維持液0.2 mL/孔，繼續(xù)在37 ℃、 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞與細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照。

1.2.3 CEF培養(yǎng)上清液HA效價(jià)及病毒感染力測(cè)定 在細(xì)胞培養(yǎng)120 h后測(cè)定培養(yǎng)液中病毒血凝效價(jià)。按 Reed-Muench 公式計(jì)算半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDV致雞胚成纖維細(xì)胞病變觀察 由表1和圖1(見中插彩版)可知，經(jīng)雞胚復(fù)壯的新城疫Ⅰ系毒株組和新城疫Ⅰ系毒株胰酶組以不同稀釋度接種細(xì)胞，均能在雞胚成纖維細(xì)胞上增殖，24 h后產(chǎn)生細(xì)胞病變，48 h產(chǎn)生典型的CPE，最初表現(xiàn)為細(xì)胞腫大，回縮變圓，折光性增強(qiáng)，形成較小的合胞體，細(xì)胞之間的空隙變大，但此時(shí)細(xì)胞單層結(jié)構(gòu)基本完整；72 h發(fā)生細(xì)胞融合和形成多核巨細(xì)胞，殘留細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀，折光性進(jìn)一步增強(qiáng)，細(xì)胞變暗；96～120 h單層呈片狀脫落，漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中。新城疫Ⅳ系毒株組，整個(gè)觀察期間未見典型的細(xì)胞病變，不產(chǎn)生CPE，細(xì)胞單層完整。而新城疫Ⅳ系毒株胰酶組，48 h后產(chǎn)生CPE，早期細(xì)胞腫大、變圓、回縮、邊界模糊；72 h后細(xì)胞病變逐漸明顯，胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡或顆粒，沒有典型的細(xì)胞融合或形成合胞體現(xiàn)象；96 h細(xì)胞單層基本完整，120 h細(xì)胞單層部分脫壁。

2.2 CEF培養(yǎng)上清液HA效價(jià)及病毒感染力測(cè)定 由表2可知，不同稀釋度的新城疫Ⅳ系毒株組在不含胰酶的CEF上不產(chǎn)生CPE，CEF培養(yǎng)上清液也測(cè)不到HA效價(jià)；新城疫Ⅳ系毒株胰酶組CEF培養(yǎng)上清液最高HA效價(jià)為27；新城疫Ⅰ系毒株組、新城疫Ⅰ系毒株胰酶組CEF培養(yǎng)上清液最高HA效價(jià)高于新城疫Ⅳ系毒株胰酶組2個(gè)滴度，TCID50也明顯增高，證明新城疫Ⅰ系毒株在CEF細(xì)胞上的感染力強(qiáng)。

表1 不同處理方式對(duì)CEF 病變率的影響

表2 不同處理方式對(duì)CEF增殖的病毒HA效價(jià)、TCID50的影響

3 討論

細(xì)胞融合是副黏病毒感染細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)標(biāo)志，也是病毒復(fù)制、致病作用的一個(gè)重要過程和手段[6]。在病毒復(fù)制過程中，融合蛋白前體F0裂解為F1和F2才能形成有感染性的子代病毒粒子，這一裂解過程是決定不同毒株毒力強(qiáng)弱的關(guān)鍵[7]。新城疫Ⅰ系毒株為中等毒力，不需要胰蛋白酶催化即能感染雞胚成纖維細(xì)胞，引起典型的CPE，這與NDV F蛋白的裂解位點(diǎn)密切相關(guān)，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)存在多個(gè)堿性氨基酸，有毒力NDV F蛋白的C端含有一對(duì)堿性氨基酸，能被宿主細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白酶識(shí)別和裂解，無需外源蛋白酶[7]。而新城疫Ⅳ系毒株需要胰蛋白酶協(xié)助才能在雞胚成纖維細(xì)胞中增殖，胰蛋白酶可以裂解所有的NDV的F0蛋白，體外處理無感染性的病毒可使其恢復(fù)感染性，新城疫Ⅳ系為低毒力毒株，只有在添加胰蛋白酶的情況下才能有效增殖[5]。胰蛋白酶可以識(shí)別新城疫Ⅳ系弱毒株的單個(gè)堿性氨基酸使F0裂解，另外胰蛋白酶也可松散細(xì)胞間的緊密結(jié)合，暴露唾液酸受體，有利于病毒與細(xì)胞的結(jié)合。本試驗(yàn)表明，在細(xì)胞維持液中添加25 μg/mL胰蛋白酶能有效地促進(jìn)新城疫Ⅳ系雞胚毒在CEF上的增殖，與新城疫Ⅰ系雞胚毒株相比，對(duì)CEF的致病變特性存在明顯差異。具體表現(xiàn)在：新城疫Ⅳ系雞胚毒在胰蛋白酶協(xié)助下致CEF變性、壞死、裂解過程緩慢，主要以胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡或顆粒為特征，沒有典型的細(xì)胞融合或形成合胞體現(xiàn)象；新城疫Ⅳ系雞胚毒感染CEF后，上清中的病毒HA最高效價(jià)比新城疫Ⅰ系雞胚毒株低2個(gè)滴度，TCID50也較低。這些結(jié)果提示，新城疫Ⅰ系雞胚毒株比新城疫Ⅳ系雞胚毒具有更強(qiáng)的促細(xì)胞融合能力和感染力。

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