香連溶液阻斷豬流行性腹瀉病毒感染的臨床效力研究

常洪濤 ， 李永濤 ， 黃慧敏 ， 張 靈 ， 侯曉礁 ， 王秀敏 ， 王川慶 ， 劉慧敏

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002 ； 2.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心 ， 北京 昌平 102206 ；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起豬的一種以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要臨床特征的腸道傳染病[1]。1978年英國、比利時首次發(fā)現(xiàn)該病[2]，隨后各主要養(yǎng)豬國家相繼報道，國內(nèi)于1984年證實存在,多年來一直嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[3]。2010年11月至今，以PEDV為主要致病因素的新生仔豬急性腹瀉疫情在全國范圍內(nèi)大暴發(fā)[4-5]，發(fā)病率和死亡率均高達90%以上，目前仍尚無有效的防控措施，抗生素治療僅能防止繼發(fā)感染[6]。已有研究表明，當(dāng)前PEDV新流行毒株較疫苗毒株CV777相比已發(fā)生較大變異，使得現(xiàn)有商品化疫苗的免疫保護效果均不理想[7]，同時新流行毒株卻又難以分離、馴化并加以應(yīng)用。以消毒為核心的生物安全措施是防控動物傳染病的最主要措施之一[8]，而選擇理想的消毒劑至關(guān)重要。當(dāng)前在養(yǎng)豬生產(chǎn)中應(yīng)用最為普遍的是醛類、含碘類、過氧化物類和表面活性劑類等化學(xué)消毒劑，它們產(chǎn)生作用迅速，消毒譜廣，對病原微生物的殺滅作用很強，但都不同程度地存在環(huán)境污染、藥物殘留、具有毒性和刺激性等副作用，并不能完全滿足疫病防控中的消毒需要。與此同時一些以中藥消毒劑為代表的新型環(huán)保消毒劑的研究逐漸展開和深入。香連溶液是一種純天然植物消毒劑，由黃連、苦參、香薷和艾葉等多味中藥提取、加工精制而成，具有殺滅病原、清新辟穢和解毒消瘡的功效，可用于動物體、環(huán)境及飲水消毒。本研究擬選用香連溶液對PEDV傳播途徑的阻斷效果進行探討，以期為有效防控PED提供一種優(yōu)質(zhì)的消毒劑。

1 材料與方法

1.1 消毒劑、疫苗和試驗動物 香連溶液由北京生泰爾科技股份有限公司提供；過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物消毒劑為江蘇省某生物工程有限公司產(chǎn)品；豬傳染性胃腸炎(TGE)-PED二聯(lián)滅活疫苗由四川某生物制品廠提供。25頭1～3日齡新生仔豬由西平縣某種豬場提供，經(jīng)檢測PED抗體為陰性；135頭臨產(chǎn)母豬由鶴壁市某正在發(fā)生PED疫情的豬場提供；隨機選擇規(guī)?；i場、中小型豬場和養(yǎng)豬專業(yè)戶各3個，每個豬場選擇20頭待產(chǎn)母豬備用，在其發(fā)生PED疫情時開展試驗。

1.2 病毒、細胞和檢測相關(guān)試劑 PEDV YM13株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室分離、鑒定并保存；Vero細胞、細胞培養(yǎng)和PEDV RT-PCR檢測[9]的相關(guān)試劑均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室提供；PED抗原快速檢測卡，購自韓國BIONOTE公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香連溶液對細胞安全濃度的測定 將香蓮溶液用DMEM分別稀釋成原液、2倍、5倍、20倍和50倍等5個稀釋度，分別接入已鋪滿單層Vero細胞的細胞板，每個濃度做2個重復(fù)，作用30 min觀察，同時設(shè)立空白對照。

1.3.2 香連溶液對PEDV增殖的抑制作用測定 將香連溶液用DMEM分別稀釋成25倍、50倍、500倍和1 000倍后，與YM13株病毒培養(yǎng)液等劑量混勻，使其藥物終濃度分別為50倍、100倍、1 000倍和2 000倍，室溫作用30 min后，再接種Vero細胞，孵育1 h，3 d后觀察并篩選最佳抑制濃度，同時設(shè)立空白對照。

1.3.3 香連溶液對PEDV感染仔豬的防治試驗 將香連溶液作50倍稀釋，YM13株病毒培養(yǎng)液作10-3稀釋后備用。將25頭1～3日齡健康仔豬隨機分為5組，隔離飼養(yǎng)，具體試驗操作見表1。

表1 仔豬分組及試驗設(shè)計

1.3.4 香連溶液對PEDV傳播途徑的阻斷試驗 選擇1個正在發(fā)生PED疫情的規(guī)?；i場，篩選待產(chǎn)母豬100頭，隨機分為10組，每組10頭，各組每日的乳頭消毒次數(shù)分別為12、10、8、6、5、4、3、2、1次和0次。同時篩選10頭設(shè)立為過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物對照組，消毒次數(shù)為6次/d。各試驗組均于分娩后首日應(yīng)用香連溶液進行乳頭擦拭消毒，持續(xù)7 d，同時篩選最佳消毒次數(shù)，并于每次消毒30 min、60 min和120 min后，隨機選擇母豬乳頭用細胞培養(yǎng)液沖洗，用于PEDV的分離和鑒定。再篩選待產(chǎn)母豬25頭，隔離飼養(yǎng)，TGE-PED二聯(lián)滅活疫苗均于產(chǎn)前40 d、20 d各免疫1次，分娩后再按篩選的最佳消毒次數(shù)進行乳頭消毒，持續(xù)7 d，具體操作見表2。

表2 母豬分組及試驗設(shè)計

1.3.5 香連溶液對PEDV傳播途徑阻斷的臨床推廣 隨機選擇規(guī)模化豬場、中小型豬場和養(yǎng)豬專業(yè)戶各3個，每個豬場選擇20頭待產(chǎn)母豬，隔離飼養(yǎng)，TGE-PED二聯(lián)滅活疫苗均為產(chǎn)前40、20 d各免疫1次，在其發(fā)生PED疫情時開展試驗。分娩后按篩選的最佳消毒次數(shù)使用香連溶液進行乳頭消毒，共持續(xù)7 d，具體操作見表3。

表3 不同規(guī)模豬場的試驗分組及試驗設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 香連溶液對Vero細胞安全濃度的測定結(jié)果 將不同稀釋度的香連溶液分別與Vero細胞作用30 min后發(fā)現(xiàn)細胞在原液和2倍稀釋時均皺縮、貼到底部，5倍稀釋時整塊漂落，20倍稀釋時有零星變圓、漂起，50倍稀釋時為正常狀態(tài)，與空白對照組相比無明顯區(qū)別(中插彩版圖1)。

2.2 香連溶液抑制病毒作用測定結(jié)果 不同稀釋度的香連溶液分別與YM13株作用后，經(jīng)計算測定其蝕斑形成單位(PFU/mL)分別為8.4×104、1.96×105、5.36×105和6.0×105，對照組為6.44×105(中插彩版圖2)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，50倍和100倍稀釋時對病毒有明顯的抑制作用，1 000倍稀釋時抑制作用不明顯，2 000倍稀釋對病毒增殖基本沒有影響，從而推斷將香連溶液作50～100倍稀釋時，可有效抑制PEDV的增殖。

2.3 香連溶液對PEDV感染仔豬的防治試驗結(jié)果 3組試驗豬分別于3 h、8 h和6 h時開始嘔吐灰紅色液體，均于24 h時發(fā)生水瀉，分別于72 h、30 h和36 h時全部脫水、死亡；過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物組均于6 h時出現(xiàn)嘔吐，12 h時發(fā)生腹瀉和脫水，24 h時全部死亡；空白對照組均于6 h時出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和嚴(yán)重脫水，24 h時全部死亡。所有試驗豬經(jīng)RT-PCR和PED抗原快速檢測卡檢測后，均為PEDV陽性(圖3、中插彩版圖4)，證實通過對初生仔豬灌服香連溶液和其他消毒劑的措施無法阻止PEDV感染和發(fā)病，但先灌服香連溶液組的病程有所延長。

圖3 PEDV RT-PCR檢測結(jié)果

2.4 傳播途徑阻斷試驗結(jié)果 試驗?zāi)肛i均于分娩后首日應(yīng)用香連溶液進行乳頭擦拭消毒試驗，共持續(xù)7 d。結(jié)果表明，各組的發(fā)病率依次為25.0%、26.3%、28.3%、29.2%、48.7%、57.5%、61.8%、87.5%、93.2%和99.5%，過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物組的發(fā)病率為68.3%，表明每日使用香連溶液進行6次以上乳頭消毒時，發(fā)病率均維持在30%以內(nèi)，且差異不顯著(P>0.05)，隨著消毒次數(shù)逐步減少，發(fā)病率也隨之大幅提高，因此，最佳消毒次數(shù)篩選為6次/d。各試驗組于每次消毒30 min和60 min后，均未分離到PEDV(中插彩版圖5)，消毒120 min后，均可分離到PEDV(中插彩版圖6)，RT-PCR檢測結(jié)果全部為陽性(圖8)。過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物組于每次消毒30 min后均未分離到PEDV，60 min后均能分離到PEDV(中插彩版圖7)，RT-PCR檢測結(jié)果全部為陽性(圖8)。免疫疫苗同時配合乳頭消毒試驗組的發(fā)病率最低，為2.8%，只免疫疫苗未進行乳頭消毒試驗組為11.4%，未免疫疫苗只進行乳頭消毒試驗組為29.1%，過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物和空白對照組分別為66.7%和97.3%。

2.5 臨床推廣結(jié)果 不同規(guī)模豬場的各組母豬均于分娩后首日使用香連溶液進行乳頭擦拭消毒試驗，持續(xù)7 d。結(jié)果表明，規(guī)?；i場、中小型豬場與養(yǎng)豬專業(yè)戶免疫疫苗組和未免疫疫苗組的平均發(fā)病率分別為8.2%和29.2%、5.7%和27.6%、4.1%和26.3%。

圖8 PEDV RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

動物傳染病必須同時具備傳染源、傳播途徑和易感動物等3個基本環(huán)節(jié)，方能構(gòu)成流行[10]。PEDV感染后以7日齡內(nèi)仔豬死亡率最高，隨年齡增加逐步降低，應(yīng)及時淘汰發(fā)病仔豬，清除傳染源。當(dāng)前PEDV流行毒株的變異使得商品化疫苗無法產(chǎn)生有效保護，“返飼”具有一定臨床效果，但存在嚴(yán)重散毒風(fēng)險，因此僅依賴疫苗免疫來保護易感豬的策略在較長一段時間內(nèi)難以實現(xiàn)。將吮乳仔豬寄養(yǎng)給健康母豬或人工哺乳，發(fā)病率和死亡率均顯著降低，說明通過技術(shù)隔離切斷其傳播途徑，可有效降低PED的臨床危害[11]。由于PEDV的抵抗力較弱，2%氫氧化鈉、1%福爾馬林和1%碘仿等傳統(tǒng)消毒劑都可將其殺滅，但均具有作用時間短和對皮膚及黏膜有強刺激性等缺點。香連溶液則是一種純天然中藥消毒劑，具有較強的抗病原體作用，且氣味清香，刺激性小、無毒和無腐蝕作用。本試驗中，將香連溶液作50倍稀釋時，對Vero細胞的生長沒有明顯影響，提示對母豬使用時較為安全，50～100倍稀釋時，對PEDV有明顯的抑制作用，因此建議在豬場進行消毒時，可將香連溶液作50～100倍稀釋后使用。對初生仔豬灌服香連溶液和其他消毒劑后，全部發(fā)病死亡，證實該措施無法阻止PEDV感染，其原因應(yīng)為PEDV的感染劑量極低，但先灌服香連溶液后可使其病程有所延長，也有力的佐證了香連溶液可抑制PEDV增殖這一結(jié)論。

母豬乳房的結(jié)構(gòu)特點，使其形成明顯的“定期放乳”這一獨特泌乳方式[12]，在產(chǎn)后最初幾天內(nèi)，一晝夜放乳次數(shù)約為24～25次。PEDV隨病豬和帶毒豬的糞便排出，主要污染母豬乳頭通過“糞-口途徑”感染[13]。本試驗中發(fā)現(xiàn)香連溶液的消毒時效性為2 h內(nèi)，應(yīng)為每晝夜消毒12次，但工作量巨大，產(chǎn)房護理人員難以承受。鑒于此，進一步研究發(fā)現(xiàn)，每晝夜消毒6次，同時通過及時清除糞便和產(chǎn)床噴霧消毒5～6次，可使PED的發(fā)病率控制至30%以內(nèi)。另外，免疫疫苗同時配合乳頭消毒試驗組的發(fā)病率僅為2.8%，提示該模式是當(dāng)前國內(nèi)豬場有效防控PEDV感染的最有效措施。臨床推廣試驗結(jié)果表明，不同規(guī)模的豬場應(yīng)用該模式均可有效阻斷PEDV的大面積感染，其中，規(guī)模化豬場和中小型豬場平均發(fā)病率均略高于養(yǎng)豬專業(yè)戶，這應(yīng)與后者多為家庭式豬場，操作者責(zé)任心較強，乳頭消毒措施實施到位有一定關(guān)系。

綜上所述，本研究所構(gòu)建的“母豬產(chǎn)前免疫PED疫苗配合產(chǎn)后使用香連溶液擦拭乳頭消毒”模式不僅可以有效阻斷PEDV的大面積感染，降低發(fā)病風(fēng)險，提高豬場經(jīng)濟效益，同時有利于我國綠色食品的發(fā)展，逐漸杜絕含抗生素和化學(xué)消毒劑殘留的食品上市銷售，并可進一步擴大其技術(shù)應(yīng)用范圍，為豬腹瀉性疫病的綜合防控工作探索出一條行之有效的技術(shù)思路。

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