氯胺酮對(duì)小型豬不同腦區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

張一鳴 ， 李曉蕾 ， 李欣然 ， 李麗娜 ， 李亞楠 ， 王宇鑫 ， 劉文瀚 ， 陳 宇 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

氯胺酮屬于苯環(huán)己哌啶類靜脈麻醉藥，基本結(jié)構(gòu)為環(huán)己胺，于20世紀(jì)70年代開始應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，因其擁有良好的鎮(zhèn)痛作用、輕度的呼吸抑制以及循環(huán)興奮等特點(diǎn)，導(dǎo)致在麻醉藥中至今仍然處于重要的地位[1]。氯胺酮在獸醫(yī)臨床上常與其他藥物組合進(jìn)行復(fù)合麻醉，可以減少麻醉藥的用量，并增強(qiáng)麻醉效果。

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)是19世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的，通過(guò)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的研究，現(xiàn)已知氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)包括興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)兩大類。神經(jīng)遞質(zhì)儲(chǔ)存于突觸囊泡并通過(guò)囊泡釋放，因此突觸囊泡的胞吐和內(nèi)吞調(diào)控對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)釋放有著重要的作用[2]。谷氨酸(GLU)由酮戊二酸經(jīng)相關(guān)酶催化合成，天門冬氨酸(ASP)則由GLU與草酰乙酸在谷草轉(zhuǎn)氨酶的作用下合成并儲(chǔ)存于囊泡中。GLU和ASP通過(guò)擴(kuò)散與突觸后膜上的特異性神經(jīng)遞質(zhì)受體結(jié)合，最終引起突觸后膜去極化，產(chǎn)生興奮性突觸后電位(EPSP)。甘氨酸(GLY)可由糖異生途徑合成，γ-氨基丁酸(GABA)是以GLU為原料，在包漿中谷氨酸脫羧酶(GAD)的作用下生成，GLY和GABA與突觸后膜上的受體結(jié)合，使突觸后膜超極化，從而產(chǎn)生抑制性突觸后電位(IPSP)。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)的重要組成部分，有研究表明，其含量的改變與腦損傷、神經(jīng)退行性病變、鎮(zhèn)痛以及學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，同時(shí)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的異常也會(huì)誘發(fā)諸如興奮性毒性反應(yīng)、帕金森病、舞蹈病以及癲癰等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3-4]。

因此，本試驗(yàn)研究氯胺酮對(duì)小型豬不同腦區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討氯胺酮在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機(jī)制，明確氯胺酮麻醉的作用部位，同時(shí)為氯胺酮的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 氯胺酮，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床外科教研室提供；谷氨酸(GLU)標(biāo)準(zhǔn)品(BCBB5881，Sigma)；甘氨酸(GLY)標(biāo)準(zhǔn)品(109K0107，Sigma)；天門冬氨酸(ASP)標(biāo)準(zhǔn)品(129K0181，Sigma)；γ-氨基丁酸(GABA) 標(biāo)準(zhǔn)品(0001446172，Sigma)；美國(guó)Waters 600高效液相色譜儀；色譜級(jí)乙腈(DIMA TECHNOLOGY INC)；色譜級(jí)甲醇(DIMA TECHNOLOGY INC)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組 3月齡健康巴馬香豬20只，雌雄兼用，體重10～15 kg，生理健康狀態(tài)良好，購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市三元養(yǎng)殖場(chǎng)。隨機(jī)取5只作為生理鹽水對(duì)照組，其余作為試驗(yàn)組，分為誘導(dǎo)組、麻醉組和恢復(fù)組，每組5只。對(duì)照組小型豬，肌肉注射生理鹽水0.07 mL/kg體重，試驗(yàn)組小型豬，肌肉注射氯胺酮0.07 mL/kg體重。

1.3 樣品采集與處理 試驗(yàn)組：肌肉注射氯胺酮溶液后，誘導(dǎo)組、麻醉組和恢復(fù)組分別在注射氯胺酮后小型豬倒地不起、翻正反射消失、翻正反射恢復(fù)時(shí)處死，取腦組織。生理鹽水對(duì)照組：肌肉注射生理鹽水溶液后立即將對(duì)照組小型豬宰殺，取腦組織。之后用生理鹽水沖洗血液，迅速于冰面上依次分離腦組織(大腦皮層、海馬、腦干、小腦和丘腦)，分別稱重后液氮冷凍，并于-80 ℃保存。

試驗(yàn)時(shí)取相應(yīng)腦組織加入9倍體積甲醇/水溶液，手動(dòng)研磨數(shù)次后將勻漿液注入到EP管中；4 ℃高速離心30 min(3 500 r/min)，取上清液低溫保存；檢測(cè)時(shí)取腦組織液400 μL，加入100 μL乙腈，混勻，4 ℃高速離心10 min(15 000 r/min)，取上清再次高速離心10 min(15 000 r/min),取上清加入0.5 mol/L NaHCO3溶液400 μL，0.5%的2，4-二硝基氟苯200 μL，渦旋混勻，置于65 ℃恒溫水浴鍋中衍生55 min，最后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，裝入進(jìn)樣瓶準(zhǔn)備進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4 RP-HPLC色譜條件 色譜柱：Symmetry C18(4.6×150 mm，5μm)美國(guó)Waters公司生產(chǎn)；流動(dòng)相：A為0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖溶液(pH值=6.2)，B為乙腈/水(V/V=50∶50)，之后進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相B的濃度由開始時(shí)65%經(jīng)10 min至10%，18 min時(shí)至40%；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：28 ℃。進(jìn)樣量為20 μL，采用外標(biāo)法定量分析，檢測(cè)各腦區(qū)氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 19軟件數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮麻醉后小型豬不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)GLU的含量 如圖1所示，氯胺酮作用下引起小型豬各腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)GLU含量變化呈先降低后升高的趨勢(shì)性。大腦、海馬、丘腦、小腦及腦干內(nèi)GLU含量在誘導(dǎo)組降至最低，與對(duì)照組相比分別降低36%、54%、39%、28%和55%，差異極顯著(P<0.01)。大腦、小腦GLU含量在麻醉組和恢復(fù)組逐漸升高，最終高于正常水平，恢復(fù)組GLU含量與對(duì)照組相比均呈極顯著差異(P<0.01)。海馬、丘腦內(nèi)GLU含量在麻醉組升至最高，與對(duì)照組相比上升15%、35%，差異極顯著(P<0.01)。腦干內(nèi)GLU含量在麻醉組升至最高，與對(duì)照組相比上升6%，差異不顯著(P>0.05)；恢復(fù)組GLU含量下降，與麻醉組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.2 氯胺酮麻醉后小型豬不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)ASP的含量 如圖2所示：氯胺酮作用下引起小型豬各腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)ASP含量變化呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)性。海馬、丘腦、小腦和腦干中ASP含量在誘導(dǎo)組降至最低，與對(duì)照組比較分別下降31%、18%、26%和37%，差異極顯著(P<0.01)。海馬、丘腦和腦干內(nèi)ASP含量在麻醉組升至最高且差異極顯著(P<0.01)；恢復(fù)組含量降低但仍高于正常水平，與麻醉組含量比較分別下降15%差異極顯著(P<0.01)，6%、3%差異不顯著(P>0.05)。小腦內(nèi)ASP含量在恢復(fù)組升至最高，與對(duì)照組、誘導(dǎo)組含量相比較差異極顯著(P<0.01)。大腦內(nèi)ASP含量逐漸增加，在麻醉組升至最高，與對(duì)照組相比升高116%，差異極顯著(P<0.01)；恢復(fù)組含量下降但仍高于正常水平，與對(duì)照組、誘導(dǎo)組含量相比差異極顯著(P<0.01)。

圖2 氯胺酮麻醉下小型豬不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)ASP的含量變化 (μg/mL， n=5)

2.3 氯胺酮麻醉后小型豬不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)GLY的含量 如圖3所示，氯胺酮作用下引起小型豬各腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)GLY含量變化呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)性。海馬和小腦內(nèi)GLY含量在誘導(dǎo)組降至最低，與對(duì)照組相比下降30%和25%，差異均不顯著(P>0.05)；麻醉組和恢復(fù)組含量逐漸上升，與對(duì)照組相比，海馬和小腦在恢復(fù)組GLY含量分別上升111%和69%，差異極顯著(P<0.01)。丘腦和腦干GLY含量在誘導(dǎo)組降至最低；麻醉組含量升至最高，與對(duì)照組相比，麻醉組GLY含量分別上升104%和36%，差異顯著(P<0.01或P<0.05)；恢復(fù)組含量下降且高于正常水平，差異顯著(P<0.01或P<0.05)。大腦內(nèi)GLY含量在麻醉組升至最高，與對(duì)照組相比上升84%，差異極顯著(P<0.01)；恢復(fù)組含量下降并高于正常水平，差異極顯著(P<0.01)。

2.4 氯胺酮麻醉后小型豬不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)GABA的含量 如圖4所示，氯胺酮作用下引起小型豬各腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)GABA含量變化呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)性。大腦內(nèi)GABA含量在麻醉組升至最高，與對(duì)照組比較上升46%，差異顯著(P<0.05)；恢復(fù)組含量下降并接近正常水平，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。海馬、小腦和腦干內(nèi)GABA含量在誘導(dǎo)組下降，與對(duì)照組相比分別下降41%和39%，差異極顯著(P<0.01)，12%差異不顯著(P>0.05)；麻醉組和恢復(fù)組GABA含量回升，均高于正常水平且差異顯著(P<0.01或P<0.05)。丘腦內(nèi)GABA含量在誘導(dǎo)組下降，麻醉組GABA含量上升，與對(duì)照組相比上升53%，差異極顯著(P<0.01)；恢復(fù)組含量下降并高于正常水平，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖3 氯胺酮麻醉下小型豬不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)GLY的含量變化 (μg/mL，n=5)

圖4 氯胺酮麻醉下小型豬不同腦區(qū)GABA的含量變化 (μg/mL，n=5)

3 討論

氯胺酮麻醉后，小型豬海馬、丘腦、小腦和腦干興奮性神經(jīng)遞質(zhì)含量分別下降43%、29%、27%和46%，因此海馬、丘腦、小腦和腦干是氯胺酮的主要作用部位；小型豬大腦和丘腦抑制性神經(jīng)遞質(zhì)含量分別升高65%和79%，因此大腦和丘腦是氯胺酮的主要作用部位。神經(jīng)遞質(zhì)作為突觸傳遞的基礎(chǔ)，其攝取、合成、釋放、重吸收以及損耗等在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)起重要作用。目前的研究表明，全麻藥可以調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的含量，進(jìn)而改變相應(yīng)受體的功能來(lái)發(fā)揮麻醉效果[5]。

GLU作為哺乳動(dòng)物腦內(nèi)含量最高的氨基酸,是錐體神經(jīng)元中最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在大腦發(fā)育、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元可塑性等方面均起重要作用[6]。Tsurugizawa等通過(guò)研究認(rèn)為異氟醚主要是通過(guò)抑制突觸前膜GLU釋放，同時(shí)增加其攝取，并降低突觸間隙GLU濃度，從而抑制興奮性神經(jīng)傳遞作用[7]。在本試驗(yàn)中，GLU在各腦區(qū)先降低后升高的趨勢(shì)和張春蘭等[9]報(bào)道的大鼠注射氯胺酮后對(duì)前額葉皮質(zhì)、海馬和杏仁體GLU含量的改變類似。作為GLU受體中最重要的NMDA受體，全麻藥可能通過(guò)抑制GLU與NMDA受體的結(jié)合，同時(shí)降低GLU突觸前膜的釋放，并增強(qiáng)GLU在突觸間隙的攝取，來(lái)調(diào)節(jié)谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性從而產(chǎn)生麻醉效應(yīng)[8]。推測(cè)可能的原因是氯胺酮與NMDA受體結(jié)合，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制GLU對(duì)該受體激活；氯胺酮降低NMDA受體通道的開放頻率及時(shí)間；氯胺酮抑制GLU的釋放，與受體結(jié)合減少，從而影響興奮性沖動(dòng)的傳遞，最后產(chǎn)生麻醉作用。

ASP作為興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，ASP亦是由突觸前膜釋放后作用于突觸后膜的GLU受體，但其作用效果不及GLU強(qiáng)烈，同時(shí)ASP在神經(jīng)系統(tǒng)興奮性信息傳遞的過(guò)程中起重要作用，并與突觸的形成、神經(jīng)細(xì)胞的存活及可塑性密切相關(guān)[10]。張燕等[11]使用與氯胺酮相類似的噻環(huán)乙胺對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)除大腦外其他4個(gè)腦區(qū)內(nèi)ASP含量降低，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。結(jié)果推測(cè)大腦可能不是麻醉藥對(duì)ASP作用的主要部位，這需要更多的研究去證實(shí)。氯胺酮產(chǎn)生的麻醉作用與小腦、海馬、腦干和丘腦這4個(gè)腦區(qū)ASP合成和釋放的減少，以及神經(jīng)元興奮性的降低有關(guān)。

GABA作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它與GLU一樣，不能通過(guò)血腦屏障，只在腦組織內(nèi)合成，有研究顯示，培養(yǎng)在人工腦脊液(ACSF)中未成熟的小鼠大腦切片中GABA作用為抑制作用[12]。Chowdhury等[13]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的氯胺酮使大鼠額前皮質(zhì)內(nèi)的GABA含量增加，這表明氯胺酮作為一種有效的臨床麻醉劑，對(duì)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的釋放有一定的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中除大腦外，其他4個(gè)腦區(qū)GABA含量的變化表現(xiàn)為一個(gè)先降低后增加的波動(dòng)趨勢(shì)，我們推測(cè)氯胺酮使用初期會(huì)對(duì)GABA的合成和釋放有抑制作用，隨時(shí)間推移這種抑制會(huì)減弱，反而增強(qiáng)GABA的合成和釋放，減少代謝和消除，從而降低神經(jīng)元興奮性，最終產(chǎn)生麻醉作用。

GLY是腦組織中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要介導(dǎo)脊髓及腦干抑制性突觸的傳遞[14]。孫建良等[15]使用異氟醚麻醉大鼠發(fā)現(xiàn)其腦內(nèi)的GLY含量升高，表明異氟醚麻醉機(jī)制可能與GLY存在著某種聯(lián)系，異氟醚產(chǎn)生的麻醉作用與增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有著直接的關(guān)系。在本試驗(yàn)中麻醉組各腦區(qū)GLY含量均高于正常水平，這表明氯胺酮麻醉劑對(duì)小型豬五個(gè)腦區(qū)都有明顯的效果，氯胺酮產(chǎn)生的麻醉效果可能是由于其促進(jìn)GLY的合成和釋放，從而增強(qiáng)抑制性突觸的傳遞有關(guān)。

4 結(jié)論

總之，我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，氯胺酮產(chǎn)生的麻醉機(jī)制可能與抑制小型豬海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，促進(jìn)大腦、丘腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)釋放相關(guān)。

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