鵝肝臟脂肪變性和鵝肥肝形成的分子保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)展

柳　序　郭松長(zhǎng)　劉耀文　曲湘勇*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙 410128)

在自然環(huán)境下，一些野生魚類在洄游前和鳥(niǎo)類在遷徙前，為了滿足長(zhǎng)途跋涉的能量?jī)?chǔ)備需求，會(huì)在短期內(nèi)大量進(jìn)食，使多余脂肪沉積在肝臟而形成脂肪肝；長(zhǎng)途遷徙后，肝臟中脂肪被消耗并恢復(fù)到正常形態(tài)，且整個(gè)過(guò)程是可逆的，不會(huì)出現(xiàn)肝硬化或壞死現(xiàn)象[1]。鵝和鴨等水禽作為鳥(niǎo)類的后代，也具備這一特性，并且在畜牧業(yè)被廣泛用于食品性脂肪肝(鵝肥肝或鴨肥肝)的生產(chǎn)[2]。而近年來(lái)人類由于脂肪代謝紊亂所造成的疾病持續(xù)上升，其中，非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的高發(fā)病率使其成為近20年來(lái)威脅世界人類健康最嚴(yán)重的疾病之一[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，填飼鵝血清中酶活性與患有NAFLD的人類或哺乳動(dòng)物血清中酶活性相似，但不同的是鵝肝臟發(fā)生嚴(yán)重脂肪變性后不會(huì)產(chǎn)生明顯的病理癥狀，表明鵝肝臟與人類或哺乳動(dòng)物肝臟脂肪沉積機(jī)理有著相似性，又有其特殊性[4]。因此，本文以鵝肝臟脂肪變性為切入點(diǎn)，主要綜述鵝肝臟脂肪變性及鵝肥肝形成的分子保護(hù)機(jī)制，為我國(guó)肥肝鵝遺傳育種工作提供理論依據(jù)，也為研究人類或哺乳動(dòng)物NAFLD提供理論參考。

1　鵝肝臟脂肪變性的機(jī)理

目前關(guān)于鵝肥肝形成機(jī)理的研究主要集中在“一次打擊”階段，即葡萄糖過(guò)量攝入到單純性脂肪肝形成階段，這也是哺乳動(dòng)物NAFLD的發(fā)病基礎(chǔ)。其主要機(jī)理是：鵝在填飼高能飼料后，肝臟中合成脂肪酸原料(葡萄糖)大量增加，生成的甘油三酯含量遠(yuǎn)超過(guò)載脂蛋白的運(yùn)輸能力，并且生成的脂肪酸遠(yuǎn)超過(guò)通過(guò)β-氧化降解的脂肪酸，造成脂肪在肝臟中大量積累，使肝細(xì)胞增大并增殖，形成比正常肝臟重5～10倍的脂肪肝[5]。因此，人們普遍認(rèn)為鵝肥肝的形成主要是由于脂肪合成、脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)以及脂肪酸β-氧化三者之間的正常生理平衡遭到破壞[6]。這一過(guò)程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖等密切相關(guān)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，IR在NAFLD的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而ERS能有效地促進(jìn)IR發(fā)生，造成脂肪在肝臟中異常沉積形成脂肪肝[9]。Geng等[10]探討鵝肥肝的形成機(jī)理，發(fā)現(xiàn)填飼能引起IR的發(fā)生，填飼組鵝肝臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記基因葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，Grp78)和X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1，Xbp1)的mRNA水平下調(diào)，脂肪酸去飽和酶基因家族(Fads)中Fads1、Fads2和Fads6的mRNA水平上調(diào)，表明在填飼過(guò)程中鵝肝臟并沒(méi)有發(fā)生ERS，這種現(xiàn)象可能是由于Fads1、Fads2和Fads6的mRNA上調(diào)作用，但填飼可以誘導(dǎo)IR和脂肪肝，并且是ERS非依賴性的，說(shuō)明鵝可能存在其他機(jī)制誘導(dǎo)IR和脂肪肝的發(fā)生。哺乳動(dòng)物脂肪以飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)為主，而鵝肝臟中脂肪主要是不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，USFA)，有研究發(fā)現(xiàn)SFA會(huì)誘導(dǎo)ERS和IR，USFA會(huì)抑制SFA的誘導(dǎo)作用[11]，這是鵝與哺乳動(dòng)物肝臟脂肪沉積“一次打擊”階段主要區(qū)別之一，由此可推斷，ERS抑制在鵝肥肝形成過(guò)程中可能具有一定的保護(hù)作用[12]。鵝在短期內(nèi)填飼，其肝臟急劇增大，說(shuō)明鵝肝臟細(xì)胞具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)和增殖能力。Wei等[13]用不同濃度的葡萄糖(0、5、25、35 mmol/L)對(duì)鵝原代肝細(xì)胞進(jìn)行48 h體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，葡萄糖組鵝肝細(xì)胞中DNA含量、細(xì)胞周期的增殖指數(shù)(proliferous index，PI)、細(xì)胞周期蛋白D(Cyclin D)和細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑p21蛋白含量和mRNA表達(dá)量都增加，說(shuō)明葡萄糖可能是通過(guò)激活Cyclin D家族和p21蛋白來(lái)促進(jìn)鵝原代肝細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[14]。并且，低濃度葡萄糖(0和5 mmol/L)對(duì)肝細(xì)胞增殖影響不明顯，高濃度葡萄糖(25和30 mmol/L)能顯著促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，由此可見(jiàn)，鵝原代肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖具有較強(qiáng)的耐受性。有研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的胰島素也能促進(jìn)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且能協(xié)同葡萄糖提高肝細(xì)胞活性，但胰島素濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞產(chǎn)生IR，使肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性降低從而抑制肝細(xì)胞的生長(zhǎng)[15-16]。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)尋找與肝臟脂肪代謝密切相關(guān)的基因來(lái)研究鵝肥肝形成的機(jī)理也取得了一定的進(jìn)展。Lu等[7]采用第2代高通量測(cè)序技術(shù)首次發(fā)布了家鵝全基因組數(shù)據(jù)，從基因組層面初步發(fā)現(xiàn)瘦素(leptin，lep)基因缺失可能是鵝肥肝形成的重要原因。Zhu等[18]用抑制性消減雜交試驗(yàn)篩選鵝正常與填飼情況下肥肝中差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)硬脂酰輔酶A脫飽和酶1(stearoyl CoA desat urease 1，SCD1)基因表達(dá)水平顯著上升，可能是通過(guò)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)的調(diào)控來(lái)促進(jìn)肝臟的脂肪合成。Osman等[19]用60 d朗德鵝填飼19 d后發(fā)現(xiàn)，填飼鵝肝臟中線粒體相關(guān)基因表達(dá)水平顯著上升，而這一研究結(jié)論與在患有NAFLD的哺乳動(dòng)物肝臟中正好相反，可能原因是SFA會(huì)增加細(xì)胞的氧化應(yīng)激、凋亡和線粒體功能障礙，而USFA可以抑制SFA誘導(dǎo)的這些副作用。為了進(jìn)一步研究鵝肥肝的形成機(jī)理，Chen等[20]通過(guò)小RNA(microRNA，miRNA)測(cè)序篩選正常組和填飼組鵝肥肝中差異表達(dá)miRNA，發(fā)現(xiàn)鵝肥肝中aan-miR-222和aan-miR-203a表達(dá)上調(diào)，aan-miR-30d、aan-miR-125b-5p和aan-miR-146a-5p表達(dá)下調(diào)，這些miRNA可能是鵝肥肝形成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-122在鵝肝臟中表達(dá)量非常高，填飼后miR-122表達(dá)下調(diào)，醛縮酶B(aldolase B，ALDOB)和M2-型丙酮酸激酶2(M2 isoform of pyruvate kinase，PKM2)基因也下調(diào)；miR-122與ALDOB和PKM2之間存在顯著的調(diào)控作用，推測(cè)ALDOB和PKM2可能是miR-122的靶基因。將鵝肥肝形成相關(guān)miRNA及其靶基因結(jié)合在一起，形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)整體，又從一個(gè)全新的層面對(duì)鵝肥肝形成機(jī)理進(jìn)行研究。一個(gè)基因的表達(dá)受其他基因的影響，而這個(gè)基因又影響著其他基因的表達(dá)，這種相互影響相互制約的關(guān)系構(gòu)成了復(fù)雜的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，因此，關(guān)于鵝肥肝形成的分子機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，這不僅有利于畜牧業(yè)食品型肥肝的生產(chǎn)，也為人類NAFLD的治療提供了新思路。

2　鵝肥肝形成的分子保護(hù)機(jī)制

在哺乳動(dòng)物NAFLD形成過(guò)程中，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化是NAFLD受到“二次打擊”或者“多重打擊”后進(jìn)一步發(fā)展的2個(gè)重要因素，也是單純性脂肪肝發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)甚至是肝硬化和肝癌的關(guān)鍵步驟[22]。而鵝肝在受到“一次打擊”形成單純性脂肪肝后并沒(méi)有明顯的病理?yè)p傷，說(shuō)明鵝肝臟在耐受單純的肝臟脂肪化方面存在其特殊機(jī)制。

2.1　脂聯(lián)素(adiponectin，ADQ)及脂聯(lián)素受體對(duì)鵝肥肝形成的保護(hù)作用

脂聯(lián)素是由脂肪組織分泌的一種細(xì)胞因子，脂聯(lián)素受體包含脂聯(lián)素受體1和2(adiponectin receptor 1 and 2，Adipor1/2)2種亞型，脂聯(lián)素及其受體在肝組織(或肝細(xì)胞)中具有抗炎、胰島素增敏和抗凋亡作用[23-24]。炎癥反應(yīng)是人類和哺乳動(dòng)物從脂肪變性發(fā)展為脂肪性肝炎的關(guān)鍵步驟，大量研究表明，在患有NAFLD的人類或哺乳動(dòng)物肝臟中炎癥標(biāo)記基因腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)mRNA表達(dá)水平顯著上升，肝臟中Adipor1/2及血液和腹部脂肪組織中脂聯(lián)素水平顯著下降[25]。而在肥肝鵝上的研究恰好相反，Geng等[26]對(duì)70日齡朗德公鵝進(jìn)行為期19 d填飼后發(fā)現(xiàn)，填飼組鵝肝臟中炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平顯著下降，Adipor1/2 mRNA表達(dá)水平顯著上升，且Adipor2 mRNA表達(dá)水平顯著高于Adipor1，Adipor2蛋白含量也顯著增加，這與Ramachandran等[27]的研究結(jié)果相一致。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，Adipor1/2在肝臟中大量表達(dá)可阻斷由SFA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[28-29]。由此可見(jiàn)，鵝在填飼后并沒(méi)有明顯的病理?yè)p傷，可能原因是脂聯(lián)素與脂聯(lián)素受體結(jié)合后，能有效地激活神經(jīng)酰胺酶分解神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺作為促炎信號(hào)神經(jīng)鞘脂類可促進(jìn)抗炎因子的分泌，進(jìn)而對(duì)鵝肥肝的形成起到保護(hù)作用。炎癥反應(yīng)和ERS一樣，都會(huì)促進(jìn)體內(nèi)發(fā)生IR。在鵝肥肝形成過(guò)程中，炎癥反應(yīng)受到抑制也進(jìn)一步說(shuō)明鵝在肝臟脂肪沉積過(guò)程中得到了保護(hù)。Xu等[30]用8～10周齡的ob/ob老鼠建模后發(fā)現(xiàn)，外源性脂聯(lián)素降低肝腫大，消耗脂肪的積累，降低肝臟TNF-α mRNA的表達(dá)及血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性。綜上所述，脂聯(lián)素受體作為鵝肥肝形成過(guò)程中的保護(hù)成分，能有效的防止鵝肝臟受到“二次打擊”，因此，推測(cè)脂聯(lián)素在治療人類和哺乳動(dòng)物的NAFLD中也具有重要作用，其可成為NAFLD的潛在新型治療方法。

2.2　抑制補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)鵝肥肝形成的保護(hù)作用

補(bǔ)體系統(tǒng)是指存在于人和動(dòng)物血清或體液中的補(bǔ)體固有成分、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白和補(bǔ)體受體，其中80%～90%在肝臟中合成。在正常生理?xiàng)l件下，多數(shù)補(bǔ)體成分以非活化形式存在，當(dāng)宿主進(jìn)行防御和炎癥應(yīng)答時(shí)，各補(bǔ)體蛋白被激活[31]。在人和鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝的形成會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)體固有成分的表達(dá)顯著增加，而敲除或抑制補(bǔ)體基因表達(dá)則可有效抑制脂肪肝的形成[32]。在鵝肥肝上的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)生了普遍抑制，這與在患有NAFLD的哺乳動(dòng)物肝臟中的表達(dá)恰好相反。Liu等[33]通過(guò)對(duì)65日齡朗德鵝進(jìn)行為期19 d填飼后發(fā)現(xiàn)，填飼組鵝肝臟中補(bǔ)體標(biāo)記基因補(bǔ)體3(C3)、補(bǔ)體4(C4)和補(bǔ)體5(C5)mRNA表達(dá)水平顯著下降，并且與腸道中乳酸桿菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步探討乳酸菌與補(bǔ)體成分之間的關(guān)系，用5和8 mmol/L的乳酸處理鵝原代肝細(xì)胞，結(jié)果顯示，乳酸組鵝肝細(xì)胞中補(bǔ)體標(biāo)記基因C5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下降，與之相關(guān)的炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)水平也顯著下降。因此，可以推斷乳酸菌的代謝產(chǎn)物乳酸是通過(guò)抑制C5 mRNA的表達(dá)進(jìn)而抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的表達(dá)，在鵝肥肝的形成過(guò)程中起到了保護(hù)作用。乳酸菌的保護(hù)作用在哺乳動(dòng)物的NAFLD中有相似的研究結(jié)論[34-35]。劉龍等[36]對(duì)70日齡朗德公鵝進(jìn)行為期19 d的填飼后發(fā)現(xiàn)，填飼組鵝肝臟中補(bǔ)體受體1(complement receptor 1，CR1)mRNA表達(dá)水平顯著上升，這是目前為止在鵝肥肝所有差異表達(dá)補(bǔ)體基因中篩選的唯一上調(diào)的補(bǔ)體基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，用不同濃度的葡萄糖(25、50、100 mmol/L)、胰島素(25、50、100 nmol/L)、棕櫚酸(0.25、0.50 mmol/L)和油酸(0.125、0.250、0.500 mmol/L)處理鵝原代肝細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)油酸和25 mmol/L葡萄糖可以顯著誘導(dǎo)CR1 mRNA的表達(dá)，而胰島素處理無(wú)顯著效果，0.50 mmol/L棕櫚酸處理還有一定的抑制作用，因此，可以推斷在鵝肥肝形成過(guò)程中補(bǔ)體受體基因CR1 mRNA表達(dá)上調(diào)可能原因是油酸和葡萄糖水平升高導(dǎo)致的。目前，關(guān)于補(bǔ)體系統(tǒng)在鵝肥肝形成中的作用和機(jī)制研究還較少，進(jìn)一步研究可為哺乳動(dòng)物NAFLD的治療提供新方法。

2.3　腸道微生物對(duì)鵝肥肝形成的保護(hù)作用

肝臟和胃腸道在解剖和功能上有著密切聯(lián)系，共同組成消化系統(tǒng)整體。自1998年Marshall提出“腸-肝軸”學(xué)說(shuō)以來(lái)，肝腸互作關(guān)系已成為當(dāng)今疾病方面的研究熱點(diǎn)[37]。人和動(dòng)物腸道內(nèi)定植有大量微生物，有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物NAFLD的發(fā)生與腸道菌群密切相關(guān)[38-39]。楊林輝等[40]通過(guò)對(duì)NASH患者腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者中腸道菌群菌種多樣性無(wú)明顯變化，但是雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量明顯減少，腸桿菌和腸球菌數(shù)量明顯增加，這與Nielsen等[41]和Cotillard等[42]的研究結(jié)果相一致。由此可見(jiàn)，腸道菌群失衡和有益菌減少可能是造成NAFLD的主要原因。鵝肥肝作為NAFLD的特殊模型，可增大5～10倍而不發(fā)生明顯的病理癥狀，近年來(lái)，有研究證實(shí)腸道微生物在鵝肥肝形成過(guò)程中具有保護(hù)作用。劉龍等[43]對(duì)70日齡朗德鵝進(jìn)行為期19 d的填飼后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，填飼組在屬水平上空腸和盲腸菌群豐度都顯著增加，乳酸菌的含量也顯著增加。Guo等[44]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物在一定程度上能夠抑制膽固醇合成酶的作用，進(jìn)而抑制血液中膽固醇水平，除此之外，腸道有益菌還能通過(guò)干擾膽鹽的循環(huán)促進(jìn)糞便中膽固醇排泄[45]，這從另一方面可以抑制NASH發(fā)生。短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)是腸道微生物的主要代謝產(chǎn)物，在填飼鵝血清中SCFA主要是丁酸，且丁酸含量與對(duì)照組相比顯著增加[33]，因此，初步推斷丁酸可能是鵝肥肝形成過(guò)程中的保護(hù)成分。

3　小結(jié)與展望

鵝肥肝富含USFA、亞油酸和卵磷脂等，在降低血脂、軟化血管、延緩衰老和預(yù)防心腦血管疾病等方面具有重要保健功效。目前，隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，關(guān)于鵝肥肝形成機(jī)理的研究從生理水平發(fā)展到基因組和轉(zhuǎn)錄組水平，取得了較大進(jìn)步。但由于鵝肥肝的形成是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過(guò)程，當(dāng)前對(duì)關(guān)鍵基因之間相互作用的研究幾乎空白，因此，關(guān)于肝臟脂肪變性的分子機(jī)理還有待深入研究。近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的不斷變化，人類NAFLD的發(fā)生率顯著上升，現(xiàn)已發(fā)展為威脅人類健康的三大肝病之一。鵝肥肝的形成與哺乳動(dòng)物NAFLD的發(fā)生有著相似性和特殊性，因此，可作為一種新型動(dòng)物模型用來(lái)研究非酒精性脂肪肝的形成機(jī)制及預(yù)防措施，為治療人類或哺乳動(dòng)物的NAFLD提供重要參考和借鑒。