山西老陳醋發(fā)酵過程中高產(chǎn)酸乳酸菌的鑒定

于迪 ，喬羽，范振宇，邢曉瑩，王如福*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷　030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷　030801)

山西老陳醋發(fā)酵過程需要霉菌、酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等眾多微生物共同參與[1]，不同微生物在不同發(fā)酵時期的代謝及相互作用為老陳醋風(fēng)味的形成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。乳酸菌能夠利用葡萄糖代謝產(chǎn)生乳酸，乳酸含量高的食醋，能夠減緩總酸含量過高帶來的尖酸刺激口感，使其酸味更加柔和、醇厚[3]。此外，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)形成的乳酸乙酯等酯類物質(zhì)，是山西老陳醋香氣的主要成分之一[4-6]。

傳統(tǒng)的乳酸菌鑒定方法需要做大量的生理生化試驗，且過程繁瑣，結(jié)果不穩(wěn)定。近年來，利用16S rDNA序列分析等分子生物技術(shù)進行微生物的鑒定已成為最常用的檢測方法[7-9]。本試驗對山西老陳醋發(fā)酵過程中酒化階段和醋化階段分離出的乳酸菌進行產(chǎn)酸試驗以及酒精、乙酸、溫度耐受性試驗，篩選出產(chǎn)酸量高、耐受性好的優(yōu)勢菌株，通過形態(tài)學(xué)特征以及16S rDNA序列分析對篩選出的優(yōu)勢乳酸菌進行鑒定。擬為下一步高產(chǎn)酸乳酸菌在山西老陳醋發(fā)酵過程中的強化應(yīng)用提供良好的菌種基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑與設(shè)備

1.1.1菌株

實驗室前期從山西老陳醋發(fā)酵過程中酒化階段的酒醪中分離出的10株乳酸菌，編號JL1～JL10；醋化階段的醋醅中分離出的25株乳酸菌，編號CL11～CL35。

1.1.2試劑

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、TAE緩沖液、rTaq DNA聚合酶(Takara公司產(chǎn)品)、DNA 分子量 Marker(Takara公司產(chǎn)品)、dNTPS(Takara 公司產(chǎn)品)。

MRS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、乙酸鈉5.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、硫酸鎂0.2 g、檸檬酸三胺2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2.0 g，定容至1000 mL，121 ℃，20 min滅菌。

50×TAE Buffer 配制方法:(1)稱量Tris 242 g，Na2EDTA·2H2O 37.2 g于1 L燒杯中；(2)向燒杯中加入約800 mL去離子水，充分攪拌均勻；(3)加入57.1 mL的冰乙酸，充分溶解；(4)用NaOH調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至1 L后，室溫保存。使用時稀釋50倍，即1×TAE Buffer。

1.1.3試驗設(shè)備

全自動高壓滅菌器MCS-3020日本三洋公司；BPX-272電熱恒溫培養(yǎng)箱上海博訊實業(yè)有限公司；9700型PCR擴增儀美國ARI公司；旋渦震蕩儀麒麟醫(yī)用儀器廠；2100型分光光度計上海光譜儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)美國RICAN BIO-RAD公司；可調(diào)式微量移液器、Centrifuge 5415R低速冷凍離心機德國Eppendorf公司。

1.2　試驗方法

1.2.1產(chǎn)酸試驗方法

菌株的活化：取出甘油保藏的35株乳酸菌，將菌液接種到滅菌后的MAS平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h后，將MAS平板長出的乳酸菌再接種到MAS斜面上，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，以此活化2次，備用。

全域旅游要求全社會參與，全民參與旅游業(yè)，加大旅游與其他產(chǎn)業(yè)的融合力度，達到資源共享。旅游交通、旅游公共服務(wù)、智慧旅游三個系統(tǒng)構(gòu)成了景區(qū)全域化發(fā)展一體化機制。借助“微社區(qū)”[6]模式突出社區(qū)居民參與，社區(qū)居民主動融入文旅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，是對自身的身份認同、文化認同、情感認同。當(dāng)?shù)鼐用駥ν鈦碛慰偷膽B(tài)度影響著當(dāng)?shù)匚穆卯a(chǎn)業(yè)的發(fā)展，所以在發(fā)展旅游產(chǎn)業(yè)的同時兼顧社區(qū)居民的綜合利益也是至關(guān)重要的。

將活化后的菌株分別接種到滅菌后的9 mL MAS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出后搖勻，移取4 mL菌液，加入36 mL蒸餾水將菌液稀釋10倍。用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH為8.2，記錄消耗的NaOH溶液的體積。用NaOH溶液的消耗量來計算乳酸菌的產(chǎn)酸量。同樣的方法做3次平行試驗。

產(chǎn)酸量計算公式(以乙酸計)為：

式中：X為菌液的產(chǎn)酸量(以乙酸計)，g/dL；V1為測定用乳酸菌菌液消耗NaOH標準滴定液的體積，mL；V2為空白培養(yǎng)基消耗NaOH標準滴定液的體積，mL；c為NaOH標準滴定液的濃度，mol/L；V為菌液的體積，mL；0.09為1.00 mL氫氧化鈉標準滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當(dāng)于乳酸的質(zhì)量，g。

1.2.2耐受性試驗方法

1.2.2.1酒精耐受性試驗方法

將活化的乳酸菌菌液按6%的比例接種于滅菌后的乙醇濃度分別為0，3%，6%，9%，12%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在分光光度計波長600 nm處測定菌液的OD值，并做空白對照試驗。

1.2.2.2乙酸耐受性試驗方法

將活化好的乳酸菌菌液按6%的比例接種于滅菌后的乙酸濃度分別為0，1，2，3，5 g/dL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在分光光度計波長600 nm處測定菌液的OD值，并做空白對照試驗。

1.2.2.3溫度耐受性試驗方法

將活化好的乳酸菌菌液按6%的比例接種于滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別在30，35，40，45，50 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在分光光度計波長600 nm處測定菌液的OD值，并做空白對照試驗[10,11]。

1.2.3形態(tài)特征觀察[12]

菌落形態(tài)觀察：觀察菌落的大小、形狀、邊緣狀況等特征，并記錄結(jié)果。

1.2.416S rDNA鑒定

1.2.4.1按試劑盒的說明進行菌株DNA提取

1.2.4.2PCR擴增

PCR擴增見表1。

表1　PCR擴增Table 1 PCR amplification

PCR反應(yīng)條件：對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，PCR擴增后，在2%瓊脂糖凝膠中加入2 μL擴增產(chǎn)物和5 μL染液充分混合后進行電泳，電泳時電壓為5 V/cm，時間為45 min，電泳液為1×TAE。通過UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳的條帶圖，見圖1。

圖1　電泳條帶圖Fig.1 Electrophoresis bar graph

1.2.4.3測序及分析

將PCR擴增后的菌株DNA送至上海生物工程股份有限公司進行16S rDNA鑒定。測序結(jié)果提交到Genbank基因庫中，通過Blast比對進行同源性分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系，對待測菌株進行鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1　高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選

經(jīng)過產(chǎn)酸量試驗后，得到35株乳酸菌的產(chǎn)酸量，見圖2。

圖2　35株乳酸菌的產(chǎn)酸量Fig.2 Acid yield of 35 strains of suspected lactic acid bacteria

經(jīng)過對35株乳酸菌產(chǎn)酸量的測定后，從中篩選出產(chǎn)酸量在7.50 g/dL以上的菌株8株，編號分別是JL6，JL9，CL20，CL21，CL28，CL29，CL31，CL33。其中產(chǎn)酸量最高的是醋化階段的CL21菌株，產(chǎn)酸量達到10.02 g/dL，其次是酒化階段的JL6菌株，產(chǎn)酸量為9.73 g/dL。

2.2　高產(chǎn)酸乳酸菌的耐受性試驗

2.2.1酒精耐受性試驗

經(jīng)過酒精耐受性試驗后，產(chǎn)酸量較高的8株乳酸菌在不同酒精濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后的菌液OD值見圖3。

圖3　8株菌株在不同酒精濃度下的OD值Fig.3 OD values of 8 strains of suspected lactic acid bacteria with different alcohol concentration

在山西老陳醋發(fā)酵過程中的酒化階段，原料中的還原糖在酒化酶的作用下轉(zhuǎn)化成乙醇，使酒醪的酒精度逐漸升高[13]，能夠達到7°～8°，甚至高至10°，所以篩選的菌株要對酒精有較好的耐受性。由圖3可知，在不同酒精濃度條件下，與其他菌株相比，JL6，CL21，CL33菌株的OD值較高，所以它們的酒精耐受性較好。其中JL6菌株在不同酒精濃度下的OD值都是最高的，其次是菌株CL21?？赡苡捎诰闖L6從酒化階段的酒醪中分離出，長期的馴化使其對酒精有較好的耐受性。

2.2.2乙酸耐受性試驗

經(jīng)過乙酸耐受性試驗后，產(chǎn)酸量較高的8株乳酸菌在不同乙酸濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后的菌液OD值見圖4。

圖4　8株菌株在不同乙酸濃度下的OD值Fig.4 OD values of 8 strains of suspected lactic acid bacteria with different acetic acid concentration

醋化階段，醋醅中底物豐富，環(huán)境也適合醋酸菌等微生物的生長，醋酸菌代謝產(chǎn)生的醋酸逐漸增多，導(dǎo)致醋醅的酸度快速增長，最高時能達到5 g/dL，因此隨著發(fā)酵的進行，只有耐酸性好的菌株，才能在醋醅中存活。由圖4可知，在不同乙酸濃度條件下，JL6，CL21，CL33菌株的OD值相對較高，其中CL21菌株的OD值在不同乙酸濃度下最高，其次是菌株JL6，最后是菌株CL33。

2.2.3溫度耐受性試驗

經(jīng)過溫度耐受性試驗后，產(chǎn)酸量相對較高的8株菌株在不同溫度條件下的OD值結(jié)果見圖5。

圖5　8株乳酸菌在不同溫度下的OD值Fig.5 OD values of 8 strains of suspected lactic acid bacteria at different temperatures

醋化階段，隨著火醅的接入，微生物活動旺盛，醋醅的溫度逐漸升高，醋酸發(fā)酵第5天，醋醅中的溫度能夠達到48 ℃[14]，因此，篩選出的優(yōu)勢乳酸菌，不僅能夠耐受較高的酒精度和酸度，同時對溫度也要有足夠的耐受性。由圖5可知，在不同溫度條件下，菌株JL6，CL21，CL33的OD值較高，其中菌株CL21的OD值最高，在45 ℃時OD值是1.725，50 ℃時OD值是0.361，其次是菌株JL6，最后是菌株CL31。

2.3　菌株的形態(tài)觀察

觀察篩選出的2株優(yōu)勢乳酸菌在MRS固體培養(yǎng)基上形成的菌落情況，單菌落形態(tài)圖見圖6。經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下觀察到的細胞形態(tài)見圖7。對其形狀、大小、顏色、表面狀態(tài)以及細胞形態(tài)等方面進行描述，見表2。

圖6　2株乳酸菌在MRS瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落Fig.6 Colony of 2 strains of lactic acid bacteria on MRS agar medium

圖7　乳酸菌菌株經(jīng)革蘭氏染色在油鏡下觀察到的細胞形態(tài)Fig.7 The morphology of lactic acid bacteria strains observed under oil microscope by Gram staining

表2　山西老陳醋發(fā)酵過程中2株乳酸菌菌落形態(tài)Table 2 Colony morphology of 2 strains of LAB isolated from fermentation of Shanxi mature vinegar

2.4　菌株16S rDNA鑒定

2.4.1PCR 擴增

將篩選出產(chǎn)酸量高、耐受性較好的2株待測乳酸菌進行DNA的提取鑒定，利用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測待測序菌株的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物。2株待測菌株的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖8。

圖8　DNA樣本進行的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.8 Electrophoresis results of PCR products

由圖8可知，1500 bp附近出現(xiàn)亮條帶，說明2株菌的 PCR產(chǎn)物擴增成功。

2.4.2系列對比

將所測序列結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站，經(jīng)BLAST檢索系統(tǒng)對序列同源性的比較分析可知2株菌分別與發(fā)酵乳桿菌和干酪乳桿菌相似。為顯示各菌株與相似菌種之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，由圖9可知，用MEGA生物學(xué)軟件中的分析法Neighbour-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]，見圖9。

圖9　菌株 16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of strain 16S rDNA gene sequences

3　討論

趙國忠等[16]對食醋發(fā)酵過程中的酒醪分離出的乳酸菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌占有數(shù)量較多，是酒化階段的主要細菌，在食醋發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用；Wu等[17]利用分子生物學(xué)技術(shù)研究山西老陳醋發(fā)酵過程中細菌真菌的生物多樣性，發(fā)現(xiàn)酒化階段的主要乳酸菌包括植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、乳酸片球菌、布氏乳桿菌等；Nie Zhiqiang等[18]在分析山西老陳醋發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)演替和多樣性時，發(fā)現(xiàn)酒化階段的乳酸菌主要為魏斯氏乳桿菌和植物乳桿菌，醋化階段的乳酸菌為瑞士乳桿菌、耐酸乳桿菌等。本試驗中酒化階段篩選出的菌株JL6為發(fā)酵乳桿菌，醋化階段篩選出的菌株CL21為干酪乳桿菌，與本領(lǐng)域中其他研究相比有一定的區(qū)別，這可能與釀醋所用原料和大曲有關(guān)，不同地域所處環(huán)境中的微生物種類不同，大曲制作過程中所接觸的微生物也各不相同，因此不同廠家的酒醪醋醅中分離出的微生物種類也有所差異。

4　結(jié)論

本文通過產(chǎn)酸定量試驗、耐受性試驗，對山西老陳醋發(fā)酵過程中分離出的35株乳酸菌進行篩選，最終篩選出產(chǎn)酸量高、耐受性好的菌株JL6，CL21，產(chǎn)酸量分別為9.73 g/dL和10.02 g/dL，經(jīng)16S rDNA鑒定分別為發(fā)酵乳桿菌和干酪乳桿菌。本研究可以為下一步研究乳酸菌的生長性能和發(fā)酵特性、菌種的選育、菌劑的生產(chǎn)以及在山西老陳醋發(fā)酵過程中的強化應(yīng)用等方面提供良好的菌種基礎(chǔ)，對推動我國食醋行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

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