mcr-1基因介導(dǎo)黏菌素耐藥性研究進(jìn)展

周 洋，劉秋云，李玉寧，張丹艷

(西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460)

抗菌藥是人類及動物對抗細(xì)菌感染的重要武器，然而隨著抗菌藥的過度使用，細(xì)菌耐藥性已成為21世紀(jì)全球衛(wèi)生和食品安全的最大威脅之一。在過去的30年，抗菌藥研發(fā)速度趨緩，而多藥耐藥性卻不斷出現(xiàn)。世界衛(wèi)生組織稱，如不采取緊急行動，我們將進(jìn)入后抗生素時代，即使普通感染和輕微損傷都會造成死亡。2010年在印度、巴基斯坦和英國出現(xiàn)產(chǎn)新德里金屬β內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-beta-lactamase 1，NDM-1)“超級細(xì)菌”，對碳青霉烯類藥物有耐藥性。2013年再次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase 2，KPC-2)。碳青霉烯類抗生素耐藥性的迅速出現(xiàn)限制了人類重癥感染的用藥選擇，碳青霉烯類抗生素的使用受到限制，臨床建議單用黏菌素或替加環(huán)素，或與其他藥物聯(lián)合使用。而黏菌素的大量使用又極大地提高了腸桿菌科對黏菌素耐藥的風(fēng)險。包括中國在內(nèi)的一些國家，黏菌素也作為獸藥使用[1]。

一般認(rèn)為，細(xì)菌對黏菌素耐藥是由于染色體上的基因變異引起，不能水平傳播，而Liu Y Y等[1]在耐藥性監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)近些年黏菌素耐藥性顯著上升，因此懷疑這種現(xiàn)象是通過質(zhì)粒介導(dǎo)。對2011年-2014年從廣東、廣西、湖南、江西和浙江五省區(qū)的醫(yī)院、生豬屠宰場、開放市場和超市采集的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌進(jìn)行可能的質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性分析，首次發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒上的mcr-1基因介導(dǎo)黏菌素耐藥性，從而導(dǎo)致該耐藥性水平傳播。緊接著，在全球各地相繼發(fā)現(xiàn)mcr-1基因，表明mcr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性在世界已廣泛存在。因此，了解mcr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性情況、在細(xì)菌和宿主的傳播、mcr-1陽性菌在全球的傳播、耐藥機(jī)制、mcr-1遺傳背景、與其他耐藥基因的共存情況以及mcr-1以外的質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥機(jī)制，對指導(dǎo)黏菌素合理應(yīng)用和新藥研發(fā)有重要意義。

1 mcr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性

1.1 mcr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性的證據(jù)

體外試驗表明，大腸埃希菌W3110電轉(zhuǎn)化pUC18-mcr-1質(zhì)粒后，對黏菌素和多黏菌素B的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)升高4倍[1]。同樣，大腸埃希菌J53通過接合分別獲得4株野生型大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌攜帶mcr-1的質(zhì)粒后對黏菌素產(chǎn)生耐藥[2]。體內(nèi)試驗表明，野生型 mcr-1陽性大腸埃希菌363R通過新生霉素處理后消除質(zhì)粒得到大腸埃希菌363S，小鼠腿部感染106CFU的363R或363S后給藥黏菌素，72 h體內(nèi)363S載菌量下降3個對數(shù)級以上，363R僅下降1個對數(shù)級[1]。

1.2 mcr-1的穩(wěn)定性

不管是野生型mcr-1陽性大腸埃希菌SHP45，還是通過接合獲得大腸埃希菌SHP45中攜帶mcr-1的質(zhì)粒pHNSHP45的耐鏈霉素的大腸埃希菌C600，無論添加黏菌素與否，連續(xù)傳代14 d，耐藥質(zhì)粒穩(wěn)定存在[1]。然而，mcr-1陽性菌株在保存后復(fù)蘇，或者在沒有黏菌素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳18代后，也會導(dǎo)致質(zhì)粒丟失，并且恢復(fù)對黏菌素的敏感性。對荷蘭2012年11月到2013年11月1 847名游客糞便樣品進(jìn)行分析，旅游前糞便不含有產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBL)腸桿菌科，旅游過程沒有接受任何醫(yī)療護(hù)理和使用抗微生物藥物，回國后1周～2周采樣發(fā)現(xiàn)6人糞便含有mcr-1陽性大腸埃希菌，1、3、6、12月后再次檢查，未檢出這些細(xì)菌，表明這些細(xì)菌僅短時間寄居或mcr-1丟失[3]。

2 mcr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性的傳播

2.1 mcr-1在不同細(xì)菌之間的傳播

mcr-1通過接合在大腸埃希菌之間轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移頻率為10-3～10-1或10-7～10-1之間，在實驗室可通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移給肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌。mcr-1在大腸埃希菌存在較普遍，發(fā)現(xiàn)于多個國家。其他細(xì)菌，如肺炎克雷伯菌[1]、產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌[4]、沙門菌(包括鼠傷寒沙門菌、羅森沙門菌[5-6])、乙型副傷寒沙門菌爪哇變種及魏爾肖沙門菌[7]，在少數(shù)國家有少數(shù)報道。彎曲菌和志賀菌尚未檢測到mcr-1基因。

2.2 mcr-1在人與動物之間傳播

mcr-1報道前，Olaitan A O等[8]對老撾的人、豬和山羊的糞便分離大腸埃希菌進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)15歲的男孩和他飼養(yǎng)的豬攜帶的耐黏菌素大腸埃希菌多位點序列分型、脈沖場凝膠電泳和毒力相同，當(dāng)時已知的和黏菌素耐藥有關(guān)的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，如pmrAB、phoPQ及mgrB，沒有發(fā)現(xiàn)變異。男孩在飼養(yǎng)過程中沒有任何防護(hù)措施，提示黏菌素耐藥性從豬傳遞給人。Liu Y Y等報道m(xù)cr-1后，Olaitan A O等[9]測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌攜帶mcr-1。廣州某寵物店工作人員患血管球性腎炎，從尿液中分離出mcr-1陽性大腸埃希菌，與其工作場所的4只犬糞便中分離出的mcr-1陽性大腸埃希菌多位點序列分型相同，并與脈沖場凝膠電泳結(jié)果一致，同時，該細(xì)菌可通過接合轉(zhuǎn)移黏菌素耐藥性到大腸埃希菌C600，表明mcr-1陽性大腸埃希菌可能在人和動物之間傳播[10]。

3 mcr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性的發(fā)生概況

3.1 mcr-1在全球范圍的傳播

繼中國首次報道m(xù)cr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性后，迅速在全球多個國家發(fā)現(xiàn)mcr-1基因的存在，分布于四大洲至少21個國家。對2008年-2016年采集的大腸埃希菌進(jìn)行檢測mcr-1發(fā)現(xiàn)，美國、波蘭、俄國老撾、阿爾及利亞和泰國僅有零星報道[11-12]，英國(人、動物及食品中陽性率<0.1%)[7]、日本(食品動物中陽性率<0.1%)[13]、西班牙(人和豬中陽性率分別為0.1%和0.4%)[14]和巴西(人、動物、食品及環(huán)境樣品中腸桿菌科陽性率為0.3%)[4]mcr-1陽性率低于0.5%，荷蘭(雞肉中陽性率1.5%)[15]、委內(nèi)瑞拉(人、豬和禽的糞便以及下水道樣品中陽性率為2.2%)[16]、南非(肉雞中陽性率為2.4%)[17]、丹麥[18](人和進(jìn)口雞肉中陽性率分別為0.2%和2.0%)、德國[19](人和動物中陽性率分別為0.4%和2.3%)低于2.5%，法國2014年火雞和肉雞中mcr-1陽性率分別為5.9%和1.8%，中國2014年生豬屠宰場、零售雞肉、零售豬肉和住院病人大腸埃希菌mcr-1陽性率分別為20.9%、28.0%、22.3%、1.4%，2011年-2014年基本呈現(xiàn)逐年上升趨勢，而突尼斯3個雞場的陽性率分別為20.0%、16.7%、83.3%。在耐藥菌或產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌中篩查mcr-1，比利時(牛和豬中陽性率為12.4%)、越南(雞、豬和生豬屠宰場中陽性率為37.5%)和阿根廷(人源大腸埃希菌陽性率為10.3%)均高于10%。mcr-1在大腸埃希菌以外的細(xì)菌中，如肺炎克雷伯菌[1](住院病人中陽性率為0.7%)、鼠傷寒沙門菌[7](人、動物和食品中陽性率低于0.1%)、乙型副傷寒沙門菌爪哇變種[7](人、動物和食品中陽性率低于0.1%)、魏爾肖沙門菌[7](人、動物和食品中陽性率低于0.1%)、羅森沙門菌[5-6](豬淋巴結(jié)中陽性率為0.6%)，mcr-1陽性率較低。

3.2 mcr-1在世界各國的流行情況

盡管在多個國家發(fā)現(xiàn)mcr-1陽性菌，但大多數(shù)報道沒有發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)流行態(tài)勢，食品動物的感染較人類感染更加嚴(yán)重，少數(shù)幾個國家mcr-1陽性率高于2.5%，大部分國家mcr-1陽性率低于0.5%。國際化貿(mào)易促進(jìn)了mcr-1的傳播。1967年到2012年(主要是2008年-2012年)從歐洲、北美和東南亞采集的超過1 100株大腸埃希菌和550株肺炎克雷伯菌中，僅發(fā)現(xiàn)1株大腸埃希菌攜帶mcr-1，表明該質(zhì)粒在這些細(xì)菌中沒有廣泛傳播[20]。荷蘭1 847名游客回國后發(fā)現(xiàn)6人糞便含有mcr-1陽性大腸埃希菌，1年內(nèi)再次采樣檢測不出mcr-1[3]。mcr-1陽性大腸埃希菌人與動物之間的傳播也僅有零星報道[9-10]。然而，突尼斯從法國進(jìn)口的1日齡雞的后代中，糞便抽樣檢測mcr-1陽性率高達(dá)83.3%[21]，遠(yuǎn)高于法國本土2013年和2014年肉雞的mcr-1陽性率(分別為1.8%和1.6%)[22]。中國2011年-2014年生豬屠宰場、零售豬肉和雞肉的mcr-1陽性率呈現(xiàn)上升趨勢，2014年的陽性率均高于20%[1]。

3.3 mcr-1出現(xiàn)的歷史

在已經(jīng)公開的包括宏基因組在內(nèi)的細(xì)菌基因數(shù)據(jù)集中追溯mcr-1，發(fā)現(xiàn)1 267份歐洲、中國和美國人糞便樣品中有3個中國人腸道微生物攜帶mcr-1，另外24個中國人的腸道樣品有mcr-1基因片段。由于這些論文在2011年8月提交，因此，采樣時間應(yīng)該在2011年前。這些結(jié)果表明mcr-1基因可能在中國已經(jīng)存在很長一段時間了，并傳播到健康人腸道，從而成為耐藥基因儲庫和水平傳播的潛在位點[23]。從300名5歲以下嬰幼兒糞便中分離大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸菌和摩根氏菌共324株，其中有5株大腸埃希菌攜帶mcr-1。這些攜帶者年齡在2月齡～27月齡之間，居住位置不同，沒有寵物或動物接觸史，其中2名嬰兒分別為2月齡和10月齡，尚未接觸常規(guī)食品和食源性微生物，可見mcr-1已經(jīng)在環(huán)境中普遍存在，或長期寄居于人體內(nèi)并通過母體傳播給下一代[24]。

Wu Congming等PCR檢測20世紀(jì)70年代到2014年中國8個省的農(nóng)場雞源大腸埃希菌是否攜帶mcr-1，發(fā)現(xiàn)mcr-1陽性菌。最早可追溯到20世紀(jì)80年代，這個時候中國的食品動物才剛剛開始使用黏菌素，此后直到2004年和2006年才開始有零星出現(xiàn)，2009年暴發(fā)[25]。

4 mcr-1介導(dǎo)耐藥性的機(jī)制

4.1 多黏菌素作用機(jī)理

多黏菌素含有10個氨基酸殘基，其中7個氨基酸殘基連接形成主環(huán)，剩余3個殘基形成線性尾部與主環(huán)相連。多黏菌素含有6個L-α和γ-二氨基丁酸，L-α和γ-二氨基丁酸使多黏菌素在生理pH下帶正電荷，革蘭陰性菌外膜脂多糖上脂質(zhì)A的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，二者通過靜電相互作用，多黏菌素從外膜擴(kuò)散到周質(zhì)，導(dǎo)致膜上形成小孔，細(xì)菌崩解。多黏菌素的疏水性尾部在破壞膜過程中起重要作用，去除多黏菌素B裂解產(chǎn)物多黏菌素九肽的疏水性尾部雖不影響與脂多糖接合，也能增大細(xì)菌細(xì)胞壁對其他抗生素的通透性，但不能有效殺滅細(xì)菌。

4.2 MCR-1蛋白的結(jié)構(gòu)

MCR-1蛋白包含2個結(jié)構(gòu)域，即內(nèi)膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域和預(yù)測含有催化中心的可溶性周質(zhì)結(jié)構(gòu)域。內(nèi)膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域親水性分布圖預(yù)測N端200個氨基酸有5個跨膜α螺旋，i-Tasser同源建模確定2個磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的可溶部分和腦膜炎雙球菌的LptA和空腸彎曲桿菌的EptC結(jié)構(gòu)最相近，序列相似度分別是41%和40%。i-Tasser生成的MCR-1蛋白模型之間在N-端(假定的跨膜部分)有差異，但各模型間以及C端結(jié)構(gòu)域的這兩個結(jié)構(gòu)的整體折疊非常一致。結(jié)構(gòu)模型和序列比對的結(jié)果顯示了MCR-1蛋白中保守的LptA和EptC對催化活性非常重要[1]。

為獲得高M(jìn)CR-1催化結(jié)構(gòu)域的分辨率結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)而了解MCR-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性的機(jī)制，構(gòu)建缺失5個跨膜螺旋的MCR-1蛋白，鋅X射線吸收限結(jié)果分析可見，在空間群P41212和P21中生成2個不同晶體形式的結(jié)構(gòu)。兩種結(jié)構(gòu)基本一致，有1個α-β-α折疊，含3個分子內(nèi)二硫鍵，典型的堿性磷酸酶或硫酸酯酶，并有相同的二聚體形式，但空間排阻色譜表明其在溶液中以單體形式存在，假定的活性位點至少含有1個鋅離子。Thr285是磷酸乙醇胺的受體中的保守氨基酸殘基，在P21結(jié)構(gòu)的活性位點中Thr285結(jié)合了1個磷酸基團(tuán)，表明晶體中同時也有磷酸化的形式。

4.3 mcr-1介導(dǎo)黏菌素的耐藥機(jī)制

MCR-1的推導(dǎo)氨基酸序列與多種細(xì)菌的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶EptA非常接近，屬于磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族成員。MCR-1蛋白通過5個跨膜螺旋將其錨定細(xì)胞質(zhì)膜的周質(zhì)中，細(xì)菌的脂多糖在胞漿中合成后通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白MsbA翻轉(zhuǎn)進(jìn)入周質(zhì)，脂多糖中的脂質(zhì)A在周質(zhì)中被磷酸乙醇胺共價修飾，修飾后的脂多糖與多黏菌素親和力下降，從而導(dǎo)致對多黏菌素耐藥性的產(chǎn)生。染色體上雙組份調(diào)控系統(tǒng)介導(dǎo)的多黏菌素耐藥機(jī)制，如pmrAB、phoPQ及mgrB，脂質(zhì)A除了被磷酸乙醇胺修飾外，還包括4-氨基-4-果膠糖，甚至脂多糖全部丟失[1]。

5 mcr-1的遺傳背景

5.1 mcr-1的來源

根據(jù)mcr-1與產(chǎn)多黏菌素菌的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)化關(guān)系， Liu Yiyun等認(rèn)為mcr-1是從未知的產(chǎn)多黏菌素菌的染色體轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌的質(zhì)粒上。Nicole Stoesser等對其采集的1株攜帶mcr-1的大腸埃希菌分析發(fā)現(xiàn)，mcr-1臨近插入序列1 294(IS1294)，嵌套于ISApl1復(fù)合轉(zhuǎn)座子中間。IS1294可利用單向滾環(huán)轉(zhuǎn)座機(jī)制轉(zhuǎn)座臨近序列，因此mcr-1可能通過IS1294插入到ISApl1后，隨后IS1294丟失，而mcr-1嵌套于ISApl1復(fù)合轉(zhuǎn)座子中間也比較常見，但也有質(zhì)粒缺失ISApl1[7,26]。

5.2 攜帶mcr-1的質(zhì)粒的多樣性

攜帶mcr-1的質(zhì)粒呈現(xiàn)多樣性，不相容組包括IncHI2、IncP、IncP、IncI2、IncFII、IncX4和IncF，質(zhì)粒大小30 kb～300 kb，GC含量41.8%～46.06%，45個～83個開放閱讀框。質(zhì)粒同源性差距較大，與最早發(fā)現(xiàn)的pHNSHP45同源性最高達(dá)98%，最低僅4%。有的質(zhì)粒中的ISApI1截短或完全缺失，編碼轉(zhuǎn)座酶的tnpA基因缺失。IncI2和IncX4均有一個長度約2 600 bp的mcr-1-pap2元件，可水平傳播到不同的質(zhì)粒中。mcr-1-pap2上、下游無同向或反向重復(fù)序列。pHNSHP45中，ISApl1直接插入到mcr-1-pap2上游，且mcr-1-pap2附近有一個25 bp的反向重復(fù)序列[2]。

5.3 染色體上的mcr-1基因

mcr-1也發(fā)現(xiàn)存在于染色體上，位于Tn9樣復(fù)合轉(zhuǎn)座子，暫時命名為TnApl，有兩個位于mcr-1-pap2附近的同向重復(fù)的ISApl1元件。TnApl位于兩個假定基因之間，含2 bp(TG)的推導(dǎo)靶位點重復(fù)序列[22]。

6 mcr-1與多藥耐藥

大腸埃希菌可同時攜帶mcr-1和多種耐藥基因，從而產(chǎn)生多藥耐藥。委內(nèi)瑞拉發(fā)現(xiàn)的一株mcr-1陽性大腸埃希菌的耐藥譜包括β-內(nèi)酰胺類藥物(包括青霉素類，頭孢菌素類和碳青霉烯類，耐藥基因有blaNDM-1、blaTEM-1、blaACT-15、blaOXA-1和blaCTX-M-15)，氨基糖苷類藥物[aadA5，aph(3′)-Ⅱa，aacA4，aac(3)-Ⅱa，strA，aadA15和strB]，氟喹諾酮類藥物[aac(6’)-Ⅰb-cr和qnrB1]，大環(huán)內(nèi)酯類藥物[mph(A)和erm(B)]，酰胺醇類藥物(catB3、catA1和floR)，磺胺類藥物(sul1、sul2和sul3)，四環(huán)素類藥物[tet(B)]，甲氧芐啶(dfrA1、dfrA12、dfrA14、dfrA17)[16]。另外，還發(fā)現(xiàn)mcr-1陽性大腸埃希菌同時攜帶fosA3(磷霉素耐藥基因)lnu(F)(林可胺類耐藥基因)。

7 其他質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因

mcr-1介導(dǎo)的黏菌素耐藥機(jī)制報道后，相繼又發(fā)現(xiàn)了mcr-2和mcr-3。mcr-2長度1 617 bp，與mcr-1比較，同源性76.75%。攜帶mcr-2的可移動元件含1個ISXO2樣轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)域，是IS1595超家族的IS元件。mcr-2下游是一個長度為297 bp的開放閱讀框，編碼PAP2膜結(jié)合脂質(zhì)磷酸酶。攜帶mcr-2的pKP37-BE質(zhì)粒長度35 104 bp，GC含量41.3%，56個蛋白編碼基因，不攜帶其他耐藥基因?；赑CR篩選結(jié)果，比利時豬源大腸埃希菌的mcr-2流行性高于mcr-1[27]。攜帶mcr-3的pWJ1質(zhì)粒261 kb，屬于IncHI2不相容組，與mcr-1和mcr-2的同源性分別是45.0%和47.0%，推導(dǎo)氨基酸序列與腸桿菌科和氣單胞菌的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶同源性分別是99.8%～100%和75.6%～94.8%。mcr-3上游含截短的殺鮭氣單胞菌特有的轉(zhuǎn)座子元件TnAs2[28]。

8 結(jié)語

mcr-1作為一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥機(jī)制的發(fā)現(xiàn)改變了以前黏菌素只能水平傳播的認(rèn)識，引起了全球的廣泛關(guān)注。我國黏菌素生產(chǎn)量和使用量均居于世界前列，并且黏菌素作為飼料添加劑使用。可能是黏菌素在動物上的大量應(yīng)用產(chǎn)生的選擇性生存壓力，為mcr-1陽性菌提供了生存優(yōu)勢，因而我國的mcr-1陽性率也較高[1]。2016年7月26日，農(nóng)業(yè)部2428號公告禁止硫酸黏菌素用于動物促生長。mcr-1與其他耐藥基因的共存可能使更多的臨床分離菌對黏菌素等耐藥，從而進(jìn)一步加劇了革蘭陰性菌對人類健康的威脅。在缺乏有效的革蘭陰性菌治療藥物的情況下，mcr-1對人類和動物的健康的威脅不容低估，mcr-1在革蘭陰性菌上的監(jiān)測和分子流行病學(xué)研究尤為必要。

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