野生反芻動(dòng)物心水病研究進(jìn)展

王彩霞，馮春燕，劉丹丹，張永寧，杜方原，劉曉飛，林祥梅，吳紹強(qiáng)

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100176)

心水病(Heartwater)是由反芻動(dòng)物埃立克體(Ehrlichiaruminantium)引起的一種以蜱為媒介反芻動(dòng)物傳染病。該病以高熱、漿膜腔積水(如心包積水)、消化道炎癥和神經(jīng)癥狀為主要特征，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報(bào)告的傳染病之一[1]，《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》將心水病列為二類動(dòng)物疫病。目前，我國尚無心水病報(bào)道。

1 歷史及地理分布

本病最早于1838年在南非的綿羊中發(fā)現(xiàn)，1858年認(rèn)為是一種特殊的家畜疾病，1898年證實(shí)為傳染性疾病，1900年明確該病是由立克次體經(jīng)希伯來鈍眼蜱傳播。1925年，Cowdry首先發(fā)現(xiàn)病原體。1980年P(guān)erray等在西半球加勒比海的瓜德羅普第一次報(bào)道了心水病。1985年首次將病原在體外培養(yǎng)成功。目前，心水病發(fā)生在幾乎所有非洲近撒哈拉沙漠國家，那里有各種鈍眼蜱屬蜱類，如馬達(dá)加斯加、瑞安、留尼汪(島)、毛里求斯、桑給巴爾、利摩羅島和圣多美群島。該病在加勒比地區(qū)也有報(bào)道，如瓜德羅普島、瑪利亞格蘭特和安提瓜島，引起了美國及西半球其他國家的關(guān)注。目前，本病發(fā)生于撒哈拉沙漠以南的大多數(shù)非洲國家和古巴、美國、法國等國家[2]。世界各地，包括我國黃河流域及其以南的廣大地區(qū)，適于鈍眼蜱的生存和攜帶病原，均受到心水病暴發(fā)的潛在威脅[3]。

2 病原學(xué)

2.1 分類地位

心水病的病原是反芻動(dòng)物埃里克體，該病原體屬于立克次體目(Rickettsiales)無漿體科 (Anaplasmataceae)，是一種小的專性細(xì)胞內(nèi)革蘭染色陰性菌[2]。

2.2 病原體的理化特性

埃立克體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生物，離開宿主細(xì)胞只能存活幾小時(shí)。遇熱不穩(wěn)定，在室溫下12 h～38 h會(huì)失活。因此，鑒于病原體的脆弱性，為保存其感染力，檢測樣本必須在干冰和液氮中保存。在二甲硫醚(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中冷凍保存也可保持病原體感染力的穩(wěn)定性，在蔗糖磷酸鉀谷氨酸培養(yǎng)基(sucrose phosphate potassium glutamic acid medium，SPG)中的冷藏效果則更好。解凍了的病原體如放置在冰上，其感染力的半衰期只有20 min～30 min[4]。

2.3 培養(yǎng)特性

埃立克體可在很多原代反芻動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞或傳代內(nèi)皮細(xì)胞中生長，但目前還沒有確定的用于分離該細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，而且細(xì)胞培養(yǎng)往往比較耗時(shí)[5]。

3 流行病學(xué)

3.1 傳染源

受感染的蜱或攜帶病原體的動(dòng)物是心水病的主要傳染源，但目前還不清楚野生反芻動(dòng)物在多長時(shí)間內(nèi)可以作為自然界中蜱的感染源，也可能是數(shù)月。此外，母畜的初乳中可能含有受感染細(xì)胞(網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)[4]，因此母畜的初乳也可能是該病的又一傳染來源。

3.2 傳播媒介

心水病通過其生物媒介鈍眼蜱屬(Amblyomma)，又稱花蜱屬的蜱進(jìn)行傳播，蜱是反芻動(dòng)物埃立克體病原穩(wěn)定的儲(chǔ)存體，病原體在蜱體可維持其感染性至少15個(gè)月。但是感染不經(jīng)蜱卵傳播[4]。

目前能夠傳播該病的蜱有13種,即彩飾鈍眼蜱(A.variegatum)、希伯來鈍眼蜱 (A.hebraeum)、A.gemma、A.lepidum、A.astrion、A.pomposum、A.sparsum、A.cohaerans、A.marmoreum、A.tholloni、斑點(diǎn)鈍眼蜱(A.maculatum，或墨西哥灣蜱)、卡延鈍眼蜱(A.cajennense)和A.dissimil。其中A.variegatum是最重要的一種，它的分布也最廣；A.astrion主要寄生于水牛；A.sparsum主要寄生于爬行動(dòng)物和水牛；A.cohaerans寄生于非洲水牛；A.marmoreum的成蟲寄生于陸龜，幼期寄生于山羊；A.tholloni的成蟲寄生于大象；A.maculatum寄生于有蹄類動(dòng)物(牛、綿羊、山羊、馬、豬、野牛、驢、騾、白尾鹿、水鹿及軸鹿)、各種肉食動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、兔類、有袋類動(dòng)物、鳥類及爬行類動(dòng)物；A.cajennense的宿主和A.maculatum相似，但是其分布沒有那么廣泛，而且是一個(gè)低效媒介；A.dissimile寄生于爬行類動(dòng)物和兩棲動(dòng)物[2,6-7]。

3.3 傳播途徑

由于該病原體十分脆弱，引起該病傳播的主要方式是引入受感染的蜱或攜帶病原體的動(dòng)物。該病還可以通過攜帶病原體的母獸的初乳垂直傳播。靜脈注射含有反芻動(dòng)物埃立克體的血液或者蜱的勻漿或細(xì)胞培養(yǎng)物，同樣也會(huì)感染該病[8]。

3.4 易感野生動(dòng)物

心水病的易感宿主范圍非常廣泛。除了家養(yǎng)反芻動(dòng)物牛、綿羊、山羊等之外，還包括野生反芻動(dòng)物。目前已知的野生動(dòng)物種類有南非白面大羚羊(Damaliscuspygargus)、牛羚(ConnochaetesgnouandC.taurinus)、非洲野牛(Synceruscaffer)、非洲旋角大羚羊(Taurotragusoryx)、長頸鹿(Giraffacamelopardalis)、大彎角羚(Tragelaphusstrepsiceros)、南非大羚羊(Hippotragusniger)、驢羚(Kobuslechekafuensis)、石羚(Raphiceruscampestris)、跳羚(Antidorcasmarsupialis)、澤羚(Tragelaphusspekii)、東帝汶鹿(Cervustimorensis)、白斑鹿(Axisaxis)、白尾鹿(Odocoileusvirginianus)、黑野羚羊等，其他疑似對(duì)心水病易感的動(dòng)物有藍(lán)牛羚、小鹿、喜馬拉雅塔爾羊、大角野綿羊、歐洲盤羊、印度羚、白犀及黑犀。此外，珍珠雞和豹龜對(duì)本病不易感，也不將病原體傳給在它們身上吸血的媒介蜱，有可能會(huì)作為心水病的病原攜帶者[9]，成為反芻動(dòng)物埃里克體的非反芻動(dòng)物病原攜帶者。黑線小鼠和多乳頭小鼠對(duì)反芻動(dòng)物埃立克體敏感，但它們均不是蜱的宿主，無法造成疫病流行。試驗(yàn)還表明，近親交配的實(shí)驗(yàn)鼠對(duì)反芻動(dòng)物埃立克體較為敏感，因此它們有望成為心水病致病機(jī)制研究的模型[10-11]。

3.5 對(duì)野生動(dòng)物的致病性

心水病可以導(dǎo)致非洲野牛、南非跳羚死亡，還會(huì)給養(yǎng)殖的野生動(dòng)物魯莎鹿、白尾鹿、羚、白斑鹿和東帝汶鹿等主要野生反芻動(dòng)物種類帶來顯著的經(jīng)濟(jì)損失。曾經(jīng)有報(bào)道稱非洲象死于心水病，但由于這頭象同時(shí)也感染了炭疽而無法證明心水病是非洲象的致死原因[9]。

4 臨床癥狀

由于宿主易感性、病原株毒力以及注射劑量的差異，心水病有最急性型、急性型、亞急性型和輕度型4種不同類型的臨床表現(xiàn)。其中最急性型表現(xiàn)為短暫的發(fā)熱、嚴(yán)重的呼吸窘迫、感覺敏感、流淚后突然死亡，有可能還會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉，偶見臨死前抽搐。這一類型的心水病較為少見[1,12]；急性型心水病在反芻動(dòng)物中最為常見。患急性型心水病的動(dòng)物一般在1周內(nèi)死亡。該病始于發(fā)熱，發(fā)病后1 d～2 d內(nèi)可超過41℃。高熱持續(xù)4周～5周，并伴有小幅度的波動(dòng)，死亡前體溫驟然下降。發(fā)熱后出現(xiàn)食欲不振、精神萎靡、腹瀉和肺水腫引起的呼吸困難，有時(shí)會(huì)逐步出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，動(dòng)物焦躁不安、繞圈行走，出現(xiàn)吸吮動(dòng)作，僵硬地站立同時(shí)有體表肌肉震顫等；亞急性型心水病，一般情況下比較少見，表現(xiàn)為發(fā)熱時(shí)間延長并伴隨咳嗽和輕度運(yùn)動(dòng)失調(diào)。動(dòng)物一般在1周～2周內(nèi)康復(fù)或死亡。這種類型的病例并不一定表現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)癥狀；輕度型也稱為亞臨床感染，僅表現(xiàn)為短暫的發(fā)熱。

根據(jù)蜱侵染程度、之前接觸感染蜱的情況以及殺螨劑保護(hù)水平，不同動(dòng)物種類的患病率差異較大?？祻?fù)的動(dòng)物通常可以獲得針對(duì)同源病株的完全免疫力，但它們?nèi)匀皇遣≡瓟y帶者[1,7]。

5 診斷方法

心水病的診斷方法主要有臨床診斷、病原體的分離與鑒定、分子生物學(xué)檢測方法及血清學(xué)檢測方法，但是心水病的確診應(yīng)該通過在涂片上觀察到病原體，或者通過PSC20套式PCR擴(kuò)增檢測并結(jié)合從內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物分離到反芻動(dòng)物埃立克體[13]。

5.1 臨床診斷

對(duì)于野生動(dòng)物，臨床癥狀很難觀察，因此很少應(yīng)用臨床診斷[9]。

5.2 鑒別診斷

最急性型心水病可能會(huì)與炭疽混淆，急性型心水病的癥狀與狂犬病、破傷風(fēng)、細(xì)菌性腦膜炎或腦炎、梨形蟲病、邊蟲病、腦錐蟲病或焦蟲病等相似，診斷時(shí)應(yīng)注意區(qū)別診斷。同時(shí)還應(yīng)注意與士的寧、鉛、離子載體和其他心肌毒素、有機(jī)磷酸酯、砷、氯化烴類或某些有毒植物的中毒相區(qū)別。此外，某些蠕蟲嚴(yán)重侵染(例如血矛線蟲病)導(dǎo)致心包積水時(shí)也會(huì)出現(xiàn)與心水病相似的癥狀[14]。

5.3 病原體的分離與鑒定

心水病可通過從血液中分離埃立克體進(jìn)行診斷。但是，由于細(xì)胞培養(yǎng)比較耗時(shí)，且考慮到動(dòng)物福利問題，一般不提倡采用[1]。

一般通過觀察大腦或血管內(nèi)膜的反芻動(dòng)物埃立克體集落進(jìn)行心水病的診斷。將腦組織進(jìn)行涂片風(fēng)干后，用甲醇固定，然后進(jìn)行姬姆薩染色。顯微鏡下觀察可見埃立克體呈紅紫色至藍(lán)色團(tuán)塊，以球狀或多形體存在于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且常常聚集在細(xì)胞核附近，呈一個(gè)環(huán)形或者馬蹄形。但是在某些使用過抗生素類藥物的動(dòng)物體內(nèi)是很難發(fā)現(xiàn)埃立克體集落的，只有在患有最急性型心水病的動(dòng)物體內(nèi)才能發(fā)現(xiàn)少數(shù)集落。而且大腦涂片中的集落數(shù)量因埃立克體株的不同而差異很大，甚至一些非常致命的病原株只有很少的菌落[15]。

5.4 分子生物學(xué)檢測方法

心水病的分子生物學(xué)檢測方法主要有DNA探針法、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和套式PCR、反向線性點(diǎn)雜交技術(shù)(reverse lineblothy bridization, RLB)、定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[16]等。

DNA探針技術(shù)的敏感性較差。PCR技術(shù)能有效檢測具有發(fā)病癥狀的動(dòng)物血液以及受感染的蜱體的埃立克體，能夠在開始發(fā)熱到恢復(fù)正常的數(shù)天后從血液中以及其他靶器官如腦、肺、腎和胸液中檢出病原基因。但PCR對(duì)攜帶病原體的動(dòng)物血液或骨髓的檢出率較低，且對(duì)于攜帶病原體動(dòng)物的檢測結(jié)果的一致性較差[17]。除了診斷之外，PCR技術(shù)還被廣泛用于埃立克體基因組和分子流行病學(xué)的研究[18]。

反向線性點(diǎn)雜交(reverse lineblothy bridization,RLB)技術(shù)可同時(shí)檢測鑒定反芻動(dòng)物無漿體和埃立克體的感染種類，該方法是將特異性探針共價(jià)連接于雜交膜，然后用獲得的PCR產(chǎn)物與之雜交。但該方法的靈敏度需要進(jìn)一步的驗(yàn)證[19]。

定量PCR只能檢測處于高熱反應(yīng)時(shí)期的感染動(dòng)物，與普通PCR一樣不能檢測攜帶病原體而無癥狀的動(dòng)物[20]。

5.5 血清學(xué)檢測方法

目前可用的血清學(xué)試驗(yàn)主要有間接熒光抗體試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISAs)和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)。由于有臨床癥狀的感染動(dòng)物在發(fā)熱反應(yīng)期間呈血清陰性，在感染痊愈后才呈血清陽性，而且采用全埃立克體作抗原時(shí)，在所有血清學(xué)試驗(yàn)中，均與其他種埃立克體(Ehrichiaspp.)發(fā)生交叉反應(yīng)，因此血清學(xué)試驗(yàn)在診斷方面的應(yīng)用非常有限[21]。

6 致病機(jī)制和疫苗研究

6.1 致病機(jī)制研究

盡管目前關(guān)于心水病的研究較為廣泛，但是關(guān)于致病機(jī)制的研究仍然很少。一般都認(rèn)為心水病的損害主要在于較小血管的輸送量增加，然而輸送量是如何增加的卻不是很清楚。

有學(xué)者總結(jié)了所有心水病感染病例的臨床病理變化，大部分變化均伴隨著發(fā)熱反應(yīng)，且在感染過程中有漸進(jìn)性貧血。有人認(rèn)為這種貧血是由骨髓抑制引起的，血細(xì)胞容量下降、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞減少是最明顯的特征，在心水病感染病例上可以觀察到一致的血象。然而，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)致病機(jī)制的研究來說似乎并不重要[22]。

6.2 疫苗研究

有報(bào)道指出可以通過免疫保護(hù)反芻動(dòng)物免受心水病的威脅，但是，在反芻動(dòng)物埃立克體不同分離株之間缺乏交叉保護(hù)，這也許是心水病一直以來都沒有商品化疫苗的原因[23-24]。

7 進(jìn)口野生動(dòng)物攜帶心水病的風(fēng)險(xiǎn)分析

我國目前尚無心水病報(bào)道，但是近年來，由于藥用、觀賞及消費(fèi)等一些需求顯著增加，我國每年從境外進(jìn)口大量偶蹄動(dòng)物，這些偶蹄動(dòng)物包括荷蘭進(jìn)口的小羊駝屬的羊駝、原駝和美洲駝羊，智利進(jìn)口的羊駝，南非進(jìn)口的河馬和長頸鹿，澳大利亞進(jìn)口的羊駝以及新西蘭進(jìn)口的馬鹿等。而這些偶蹄動(dòng)物恰恰是心水病的易感動(dòng)物，因此，心水病對(duì)我國的國門生物安全存在著潛在傳入風(fēng)險(xiǎn)。為保證進(jìn)口野生動(dòng)物的安全，保障相關(guān)貿(mào)易的順利開展，必須對(duì)進(jìn)口國家可能傳帶心水病的野生動(dòng)物開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并提出應(yīng)對(duì)措施。

8 口岸檢疫應(yīng)采取的防控措施

8.1 加強(qiáng)進(jìn)境檢驗(yàn)檢疫監(jiān)管

心水病通常是通過包括隱性感染的病原攜帶者在內(nèi)的感染動(dòng)物或者蜱傳播至新的地區(qū)。蜱可由非法進(jìn)口動(dòng)物或者候鳥帶入一個(gè)國家，因此，在心水病非疫區(qū)國家，必須對(duì)從疫區(qū)輸入的反芻動(dòng)物進(jìn)行進(jìn)口前的檢驗(yàn)，所有可能攜帶鈍眼蜱屬的動(dòng)物，包括一些非反芻的動(dòng)物種類，必須在入境前進(jìn)行蜱的檢驗(yàn)。

8.2 做好疫病檢測監(jiān)測技術(shù)儲(chǔ)備

為了及時(shí)監(jiān)控疫情，防止疫情的擴(kuò)散與傳播，必須加強(qiáng)檢測技術(shù)研究，同時(shí)進(jìn)一步研究探索其生物和流行特征并監(jiān)測其感染狀態(tài)，以達(dá)到精準(zhǔn)快速的疫情預(yù)警。并且嚴(yán)格規(guī)范檢驗(yàn)檢疫操作程序，避免醫(yī)源性的動(dòng)物間的血液轉(zhuǎn)移。

8.3 清潔環(huán)境，切斷傳播途徑

清潔環(huán)境，定期殺蜱，或妥善處理感染動(dòng)物，避免蜱吸食感染動(dòng)物血液，從而造成疫情的傳播[25]。

8.4 疫苗防控

目前沒有可用的商品化疫苗。對(duì)心水病唯一的商品化免疫方法仍然是“感染治療”法，即使用感染的血液然后對(duì)有反應(yīng)的動(dòng)物進(jìn)行四環(huán)素處理。這種方法在一些地區(qū)一直沿用至今，但它可能很快會(huì)被減毒或滅活疫苗所代替。

目前的“疫苗接種”首先是接種活的埃立克體病原，當(dāng)出現(xiàn)發(fā)熱癥狀時(shí)用抗生素處理。此接種方法可用于幼畜。但是這種疫苗接種方式并不能保護(hù)動(dòng)物免受所有埃立克體野株的感染，而且由于過敏性反應(yīng)，再次接種也是有風(fēng)險(xiǎn)的[2]。

9 展望

綜上所述，心水病對(duì)野生動(dòng)物的危害還是比較大的，目前雖然心水病的相關(guān)研究，從檢測確診到疫苗防控均已較為全面，但是我國對(duì)于心水病的研究較少，這也許與我國無心水病有關(guān)，而我們每年也會(huì)從國外進(jìn)口不少野生動(dòng)物，為了御疫于國門之外，不但要在進(jìn)口動(dòng)物之前做好風(fēng)險(xiǎn)分析，還應(yīng)該加強(qiáng)該病檢測技術(shù)體系的建設(shè)。

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