哈蟆油對(duì)哮喘豚鼠炎性因子及肺組織病理變化的影響

仇志凱，曲 元，馬 超，律廣富， 常詩(shī)卓，葉鴻 博，林 賀，林 喆*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)， 長(zhǎng)春 130117 ；2.長(zhǎng)春人民藥業(yè)集團(tuán)有限公司 公益管理平臺(tái)， 長(zhǎng)春 130021）

哈蟆油（Oviductus Ranae）為中國(guó)林蛙雌蛙輸卵管的干制品，是其主要藥用部位，自1985年被《中國(guó)藥典》收錄。性平，歸腎、肺經(jīng)，味甘、咸，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、補(bǔ)腎益精、健脾養(yǎng)胃之功效[1-2]。目前，對(duì)于支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，西醫(yī)認(rèn)為，多是由氣道炎癥導(dǎo)致[3]，廣泛認(rèn)同的是IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)導(dǎo)致的炎性浸潤(rùn)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)則認(rèn)為，哮喘是由于肺腎氣虛所致，《類(lèi)癥治裁·喘證》指出：“肺為氣之主，腎為氣之根，肺主出氣，腎主納氣，陰陽(yáng)相交，呼吸乃和，若出入升降失常，斯喘作焉”[4-5]。本研究從哈蟆油滋陰潤(rùn)肺的傳統(tǒng)功效入手，分析其對(duì)豚鼠血中炎性因子及肺部病理變化的影響，探討哈蟆油對(duì)哮喘的現(xiàn)代藥理作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF健康豚鼠，60只，體質(zhì)量250～300 g，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（吉）- 2016-0004。

1.2 試劑 哈蟆油（通化鼎參藥業(yè)），醋酸地塞米松片（遂成藥業(yè)股份有限公司，160226），卵清蛋白（Sigma，#SLBS6919），氯化鈉（北京化工廠(chǎng)，20170117），水合氯醛（天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)，20160320），無(wú)水乙醇（北京化工廠(chǎng)，20170515），4%多聚甲醛固定液（長(zhǎng)春金泰化玻，20170621），二甲苯（北京化工廠(chǎng)，20170410），蘇木精染液（長(zhǎng)春賽默瑞特，SM-RT-001），伊紅染液（長(zhǎng)春賽默瑞特，SM-RT-007），IL-4、IL-5、IgE酶聯(lián)免疫試劑盒（上海源葉，E20170601A）。

1.3 儀器 WP-UP-III-40精密型超體純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司），MS-PB型磁力攪拌器（DRAGON LAB），JA2003B分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），JSC-202超聲霧化器（遼寧鞍山電子醫(yī)療儀器廠(chǎng)），Multiskan FC型酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾），TS-12U型生物自動(dòng)組織脫水機(jī)（湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），TB-718D型生物組織包埋機(jī)（湖北泰維科技），HM340E型切片機(jī)（Thermo Scientifi c），TR-180型生物組織全自動(dòng)染色機(jī)（湖北泰維科技），DM2500型顯微鏡（德國(guó)徠卡）。

2 方法

2.1 藥物的制備

2.1.1 造模藥的制備 生理鹽水：4.5 g NaCl，溶于500 mL dd H2O；10%卵清蛋白：準(zhǔn)確稱(chēng)取卵清蛋白5 g，溶于50 mL生理鹽水；1%卵清蛋白：準(zhǔn)確稱(chēng)取卵清蛋白2.5 g，溶于250 mL生理鹽水。

2.1.2 治療藥的制備 地塞米松：根據(jù)陽(yáng)性組豚鼠體質(zhì)量，按給藥量1 mg/kg、給藥體積1 mL/100 g稱(chēng)取地塞米松并溶于相應(yīng)蒸餾水中；哈蟆油高、中、低劑量藥物的制備：根據(jù)給藥量400、200 、100 mg/kg稱(chēng)取蛤蟆油，按給藥體積1 mL/100 g用相應(yīng)ddH2O充分泡發(fā)24 h后，勻漿機(jī)制備成混懸液。

2.2 分組 60只健康豚鼠，每組10只，按體質(zhì)量隨機(jī)分成空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（地塞米松，1 mg/kg）、哈蟆油高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg）。

2.3 造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，各組腹腔注射給予1 mL的10%卵清蛋白，腹腔注射后第8天開(kāi)始，除空白組外，各組豚鼠分別放入霧化誘喘儀容器內(nèi)，用1%卵清蛋白進(jìn)行霧化吸入激發(fā)誘喘5 mim（首次霧化時(shí)，若出現(xiàn)呼吸急促，尖叫，四肢癱軟癥狀，立刻取出豚鼠），隔日1次，共計(jì)7次；空白組用等量生理鹽水進(jìn)行同等操作[6-8]。

2.4 給藥 腹腔注射后第8天開(kāi)始，每次霧化前30 min進(jìn)行灌胃給藥，空白組和模型組給予生理鹽水、陽(yáng)性組給予地塞米松1 mg/kg、哈蟆油高、中、低劑量組給予哈蟆油混懸液400、200 、100 mg/kg，給藥體積均為1 mL/100 g。

2.5 動(dòng)物處理 末次霧化20 min后，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）予以麻醉，進(jìn)行采樣。

2.5.1 炎性因子檢測(cè) 腹主動(dòng)脈取血，置于常規(guī)10 mL的EP管中，3 000 r/min離心10 min后，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中IL-4、IL-5、IgE的含量。

2.5.2 病理切片的取材及制作[9-10]打開(kāi)胸腔，分離右中肺組織，置于4%多聚甲醛固定液固定，經(jīng)70%～100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染液染色，通過(guò)病理圖像分析系統(tǒng)觀(guān)察肺部組織病理變化情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)血清中IL-4、IL-5、IgE含量的影響 給藥后與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、哈蟆油高、中劑量組均能顯著降低IL-4、IL-5、IgE的含量（P＜0.01），而哈蟆油低劑量組的療效稍弱一些（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組豚鼠外周血中IL-4、IL-5、IgE含量變化（，n = 10）

表1 各組豚鼠外周血中IL-4、IL-5、IgE含量變化（，n = 10）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 IL-4/（pg/mL） IL-5/（pg/mL） IgE/（μg/mL）空白組 6.76±1.39 11.26±1.66 33.64±4.66模型組 11.81±3.84##28.53±3.62##67.88±6.18##陽(yáng)性對(duì)照組 7.18±5.08△△13.26±3.20△△37.13±6.49△△哈蟆油高劑量組 8.51±2.70△△12.49±3.79△△34.06±9.85△△哈蟆油中劑量組 9.05±1.50△△13.93±2.40△△38.85±8.91△△哈蟆油低劑量組10.96±6.76△ 22.54±5.44△ 56.39±4.02△

3.2 肺部組織結(jié)構(gòu)的病理改變 顯微鏡下觀(guān)察肺部組織的病理改變，通過(guò)病理圖像處理軟件獲取圖像：與空白組相比，其余各組均出現(xiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織平滑肌增厚以及氣道變窄現(xiàn)象。模型組最為顯著，表現(xiàn)為大量炎性細(xì)胞聚集對(duì)組織造成炎性浸潤(rùn)、平滑肌增厚、氣道變窄；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和哈蟆油高劑量組的炎性細(xì)胞明顯減少、組織增厚現(xiàn)象顯著降低；與陽(yáng)性對(duì)照組、哈蟆油高劑量組相比，哈蟆油中、低劑量組炎性細(xì)胞有所增加，組織增厚，但相對(duì)于模型組，依然明顯降低。病理結(jié)果提示，哈蟆油可降低哮喘豚鼠的肺部組織的炎性浸潤(rùn)及氣道損傷，從而減輕豚鼠哮喘癥狀。

4 討論

目前，對(duì)于支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，在西醫(yī)臨床還未完全明確，主要有氣道重塑、IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)、炎性浸潤(rùn)等。其中被廣泛認(rèn)同的是I型超敏反應(yīng)導(dǎo)致的炎性浸潤(rùn)，大量研究[11]證明，哮喘發(fā)生時(shí)，機(jī)體的Th1/Th2會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的失衡現(xiàn)象，導(dǎo)致Th2占主導(dǎo)，產(chǎn)生大量的IL-4、IL-5（其中IL-4是其特征性細(xì)胞因子），并進(jìn)一步促進(jìn)免疫球蛋白IgE和嗜酸性粒細(xì)胞EOS的活化和聚集，使氣道出現(xiàn)大量黏液并伴隨纖維化增厚現(xiàn)象。所以，檢測(cè)IL-4、IL-5以及IgE的含量，對(duì)于哮喘的判別有一定的說(shuō)明意義。

中醫(yī)認(rèn)為，哮喘是“水濕內(nèi)聚為痰，伏藏于肺，遇外邪誘發(fā)，痰阻氣道發(fā)為哮病?！薄端貑?wèn)·五藏生成篇》指出：“諸氣者皆屬于肺。”肺臟受損，則一身之氣受損，運(yùn)行不暢，致虛致瘀，氣屬陽(yáng)，久瘀則生熱，灼傷陰液，轉(zhuǎn)變?yōu)榉侮幪撟C。哈蟆油則兼具養(yǎng)陰潤(rùn)肺、補(bǔ)腎益精的雙重作用[12-15]。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證明，哈蟆油可顯著降低豚鼠血清中的IL-4、IL-5、IgE的含量、并且顯著減少豚鼠的肺部組織的炎性浸潤(rùn)，避免炎性因子對(duì)肺部造成損傷；同時(shí)降低組織平滑肌增厚，氣道狹窄等癥狀，利于肺氣及津液的流動(dòng)，減輕“喘證”的發(fā)作，其作用機(jī)制應(yīng)該與調(diào)節(jié)機(jī)體的Th1/Th2失衡、降低炎性細(xì)胞的分泌，改善肺部氣道重塑有關(guān)，從而緩解機(jī)體的哮喘癥狀。其相應(yīng)的信號(hào)通路，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鮑悅,姜威,劉冬. 中國(guó)林蛙的藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2016, 18(8):1077-1080.

[2]王丹彤,王丹輝. 林蛙油化學(xué)成分及藥理作用研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 31(6):1127-1129.

[3]KHORASANIZADEH MIRHOJJAT, ESKIAN MAHSA,GELFAND ERWIN W, et al. Mitogenactivated Protein Kinases as Therapeutic Targets for Asthma[J]. PHARMACOLOGY &THERAPEUTICS, 2017(174):112 -126.

[4]張偉,王國(guó)梁.試談肺陰虛型咳嗽[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥, 2012,32(5):14-15.

[5]楊蓉青. 肺陽(yáng)虛說(shuō)略[J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2005, 32(7):664-665.

[6] 劉貴穎,張慧琪,朱振剛,等.卵清蛋白致敏大鼠支氣管哮喘模型的制備[J].臨床肺科雜志, 2013, 18(7):1167-1169.

[7]林志榮,王維剛,嚴(yán)惠敏,等.卵清蛋白誘導(dǎo)129 Sv小鼠建立哮喘模型的方法[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2011,33(9):964-968.

[8] 李翎,方永奇,鄒衍衍. β-細(xì)辛醚噴霧給藥對(duì)哮喘模型豚鼠白細(xì)胞介素- 4、白細(xì)胞介素- 6、γ-干擾素水平的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志, 2013, 28(9):2704-2706.

[9] 潘豐滿(mǎn),張燕翔,李祥華,等.止哮平喘方對(duì)哮喘大鼠肺組織EOS凋亡及FAS, Bcl-2 基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(18):219-222.

[10] 陳賀,張慧穎,劉禾,等. 復(fù)方川貝顆粒對(duì) OVA 介導(dǎo)的豚鼠過(guò)敏性哮喘模型的平喘作用機(jī)制研究[J].中國(guó)實(shí) 驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(18):228-231.

[11] ZHANG Yinping, LI Baizhan, HUANG Chen, et al. Ten cit ies cross-sectional questionnaire survey of children asthma and other allergies in China [J]. Chinese Science Bulletin,2013, 58(34):4182-4189.

[12] 陳金生. 養(yǎng)陰清肺化瘀法治療 陰虛咳嗽的臨床研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué), 2006.

[13] 邵雨萌. 論肺陽(yáng)[D]. 濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué), 2012.

[14] 許衛(wèi)華. 哮喘中醫(yī)證型與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微觀(guān)指標(biāo)的相關(guān)性研究[D]. 北京:北京中醫(yī)藥大學(xué), 2005 .

[15] 金香男,延光海,金哲悟. 林蛙油化學(xué)成分及藥理作用研究[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 37(2):101-104.