金黃連口服液對(duì)雞呼吸道致病菌的抑菌作用研究

李瑞娟，梁 娜，馮 芳，王小娜

（河北新華科極獸藥集團(tuán)有限公司，河北石家莊051430）

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試菌珠：雞源性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種（O78）、副雞嗜血桿菌，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株S6（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院）

1.1.2藥品與試劑：金黃連口服液 （河北新華科極獸藥集團(tuán)），由連翹、蒲公英、黃芩、金銀花、板藍(lán)根，購(gòu)自安國(guó)藥材批發(fā)市場(chǎng)；魚腥草口服液（河北新華科極獸藥集團(tuán)）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限公司）；營(yíng)養(yǎng)肉湯（北京陸橋技術(shù)有限公司）。

1.1.3儀器與設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈集團(tuán)空氣技術(shù)有限公司）等。

1.2　方法

1.2.1金黃連口服液的制備

由連翹、蒲公英、黃芩、金銀花、板藍(lán)根5種中藥組成，連翹蒸餾提取揮發(fā)性物質(zhì)，收集揮發(fā)性物質(zhì)，備用；蒸餾后的水溶液另器收集；藥渣與其余蒲公英等四味加水煎煮1.5h，煎液濾過(guò)，濾液備用；藥渣加水再煎煮1.0h，煎液濾過(guò)，濾液與上述兩種水溶液合并，減壓濃縮至一定體積，冷至40℃時(shí)加入乙醇，使含醇量達(dá)75%，充分?jǐn)嚢?，靜置12h，濾取上清液，殘?jiān)?5%乙醇適量，攪勻，靜置12h，濾過(guò)，合并乙醇液，回收乙醇至無(wú)醇味，加入連翹蒸餾液再加水制成，分裝，置于4℃冰箱保存，備用。

1.2.2菌種準(zhǔn)備

大腸桿菌O78、副雞嗜血桿菌，將試驗(yàn)菌種分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂及雞血清肉湯瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h，然后挑取普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)典型菌落于3mL生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁，調(diào)整濁度與比濁管（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┫嗤?/p>

雞毒支原體S6株，將適量改良Frey氏培養(yǎng)液加入冷凍保存的菌種中，使凍干菌種復(fù)水?；靹蚝髮⒒旌衔镆浦灿?mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，置于37℃5%～10%CO2和相對(duì)濕度為80%～90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5d后培養(yǎng)基顏色變橙黃色或黃色，再傳2代，測(cè)定顏色變化單位（108ccu/mL）并稀釋至104ccu/mL作為本試驗(yàn)用菌液。

1.2.3藥物敏感性試驗(yàn)

先于無(wú)菌平皿內(nèi)加入20mL適宜的瓊脂作底層，再用培養(yǎng)16～18h的目標(biāo)菌液2mL與18mL的適宜瓊脂混合均勻作上層，凝固后用直徑為1cm的打孔器在培養(yǎng)基上等距離打孔6個(gè)，孔徑大小、深度保持均勻，于孔中加滿濃度為1g/mL的供試藥液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，（雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株S6、副雞嗜血桿菌需封閉培養(yǎng)皿置于37℃含5%～10%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10d）測(cè)量抑菌圈直徑，每種藥液做3次重復(fù)，求平均值，每種菌均按照此方法進(jìn)行試驗(yàn)。

抑菌結(jié)果判定方法：抑菌效果按《中藥藥理學(xué)》中的標(biāo)準(zhǔn)判定，抑菌直徑＞20mm 為極敏記為（++++），15～19mm 為高敏，記為（+++）；10～14mm 為中敏， 記為 （++）；10mm 以下為低敏， 記為（+）；“—”表示無(wú)抑菌作用。

1.2.4藥物最小抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)

取13×100mm滅菌試管11支并編號(hào)，每管加入無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基2mL，然后于第1管中加入受試中藥口服液2mL，混勻后取出2mL加入第2管中，以此類推，直到第9管中取出2mL棄去，第10管不加藥液作陽(yáng)性對(duì)照，第11管加入受試藥液2mL，混勻后取2mL棄去，不加細(xì)菌作陰性對(duì)照。然后向3個(gè)組的兩種藥液的每個(gè)稀釋度分別加入大腸桿菌O78、雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株S6、副雞嗜血桿菌懸液0.1mL，搖勻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h， 第 1～9 管藥物濃度分別為 500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.8、3.9、2.0mg/mL。以不發(fā)生混濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥物的最低藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC），根據(jù)MIC值來(lái)評(píng)價(jià)中藥的體外抑菌活性[1-3]。

2　結(jié)果

2.1　金黃連口服液對(duì)各試驗(yàn)菌株的抑菌圈直徑的影響

金黃連口服液對(duì)引起雞呼吸道疾病3種主要致病菌的抑菌效果見(jiàn)表2-1。結(jié)果顯示，金黃連口服液對(duì)大腸桿菌O78型、副雞嗜血桿菌、雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株S6株均表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的抑菌活性，其抑菌直徑分別為13.1mm、12.6mm、14.3mm，優(yōu)于對(duì)照藥物魚腥草口服液（10.4mm、9.2mm、10.5mm）的抑制效果。表明，金黃連口服液對(duì)多種雞呼吸道致病菌有一定程度的抵抗作用。

2.2　金黃連口服液的最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

金黃連口服液最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2-2。結(jié)果顯示，金黃連口服液對(duì)大腸桿菌O78型、副雞嗜血桿菌、雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株 S6的最小抑菌濃度 MIC值為 62.5mg/mL、125.0mg/mL、62.50mg/mL，較 魚 腥 草 口 服 液 （250.0mg/mL、125.0mg/mL、125.0mg/mL）作用明顯。

3　分析與討論

大腸桿菌、副雞嗜血桿菌等細(xì)菌為臨床上常見(jiàn)致病菌，將金黃連口服液和魚腥草口服液對(duì)致病菌進(jìn)行抑菌活性研究對(duì)防治由這些細(xì)菌引起的感染具有重要意義。本試驗(yàn)通過(guò)采用藥物敏感性試驗(yàn)的打孔法及最小抑菌濃度試驗(yàn)的試管二倍稀釋法研究了金黃連口服液的體外抑菌作用。結(jié)果顯示，金黃連口服液對(duì)大腸桿菌、副雞嗜血桿菌、支原體均表現(xiàn)出一定的抑制作用，且抑制效果強(qiáng)于魚腥草口服液對(duì)照組，這與田樂(lè)，楊紅文等的報(bào)道結(jié)果相似[4-5]。表明，金黃連口服液可作為一種良好的臨床抗菌藥，具有較強(qiáng)的產(chǎn)品開發(fā)價(jià)值。

據(jù)報(bào)道，金黃連口服液方劑中各味藥均具有明顯的抗菌作用，君藥連翹中的有效成分異連翹酯苷和連翹酯苷均有較強(qiáng)的抑菌能力，是連翹中極有前景的植物抗菌活性成分，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌均有明顯的抑制作用。臣藥蒲公英具有廣譜抑菌活性，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行體外的抑菌實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)蒲公英對(duì)葡萄球菌屬細(xì)菌、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌、腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、流感嗜血桿菌等常見(jiàn)臨床分離細(xì)菌有明顯的抗菌活性。體外研究發(fā)現(xiàn)，黃芩生品及炮制品對(duì)痢疾桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌有效。佐藥金銀花為作用較強(qiáng)的廣譜抗菌中藥，對(duì)金黃色葡萄糖球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌和變形桿菌等有抑菌作用。板藍(lán)根對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性桿菌亦有一定的抑制作用，其抑菌的有效成分為色胺酮和一些化學(xué)結(jié)構(gòu)尚未闡明的吲哚類衍生物[6-8]。

4　結(jié)論

金黃連口服液對(duì)臨床常見(jiàn)呼吸道致病菌具有明顯的抑制作用，其效果優(yōu)于魚腥草口服液。

注:同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

表2-1　金黃連口服液及魚腥草口服液對(duì)3種主要致病菌的抑菌作用

表2-2　金黃連口服液及魚腥草口服液最小抑菌濃度（m g/m L）

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