連作花生土壤理化性質(zhì)的變化特征及其與土壤微生物相關(guān)性分析

石程仁，禹山林，杜秉海，楊 珍，陳 娜，潘麗娟，王 通，王 冕，遲曉元 ，陳明娜,*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271000)

花生是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，多種植于丘陵、旱薄地，據(jù)統(tǒng)計(jì)2016年我國(guó)花生種植面積472.67萬(wàn)公頃，占油料作物宗面積的33.43%[1-2]。由于我國(guó)花生產(chǎn)區(qū)相對(duì)集中，加上種植效益和環(huán)境條件等各方面因素的影響，花生連作現(xiàn)象普遍，山東、河南等主產(chǎn)區(qū)常多年連片、大規(guī)模種植，有的甚至連作了10～20年[1]。連作使花生病蟲害加劇，品質(zhì)下降，連作 2～3 年，莢果平均減產(chǎn)19.8%～33.4%[3-4]。連作障礙已成為當(dāng)前我國(guó)花生生產(chǎn)面臨的突出問題之一。研究發(fā)現(xiàn)，造成連作障礙的因素主要包括土壤營(yíng)養(yǎng)元素失衡，作物根系分泌物、腐解物等化感物質(zhì)的自毒作用，土壤微生物區(qū)系失衡，土壤酶活性改變等方面，歸結(jié)起來(lái)就是根際微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生改變[5]。

作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的吸收具有偏好性，同樣花生對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素也有特定的需求種類和吸收比例，長(zhǎng)期單一種植必然會(huì)使土壤中營(yíng)養(yǎng)元素失衡[5]。封海勝等[6]曾報(bào)道，中等肥力砂壤土花生連作三年后，土壤中速效磷、速效鉀和速效硼的含量較輪作土壤中分別減少了52.9%、40.6%和53.8%，水解氮含量變化不大?；ㄉL(zhǎng)期連作使得從土壤中吸收的氮素較少，氮肥利用率和產(chǎn)投比降低；而對(duì)磷、鉀、硼、鐵、鈣等元素的吸收量較多[7-8]，導(dǎo)致土壤中營(yíng)養(yǎng)元素失衡，花生的生長(zhǎng)發(fā)育就會(huì)受到影響，抗逆能力降低，從而使其產(chǎn)量和品質(zhì)下降。

根際微生態(tài)系統(tǒng)是一個(gè)以植物為主體，以植物—土壤—微生物及其環(huán)境條件相互作用過程為主要內(nèi)容的有機(jī)系統(tǒng)[3]。植物、土壤、微生物的相互關(guān)系維系著根際微生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)功能。微生物是根際微生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵因子，在土壤物質(zhì)循環(huán)中起重要作用，植物—土壤之間的相互作用一般會(huì)通過土壤微生物進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。微生物的生長(zhǎng)代謝不僅與花生的生長(zhǎng)、發(fā)育密切相關(guān)，而且能敏銳反映土壤微環(huán)境的變化[10-11]。因此，本研究通過分析花生連作過程中根系土壤營(yíng)養(yǎng)元素的變化特征及其與花生根系微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，可以有效闡明花生連作過程中根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的變化情況，對(duì)了解連作花生土壤微生態(tài)系統(tǒng)各因子之間的相互關(guān)系具有十分重要的意義，為進(jìn)一步探究花生連作障礙的關(guān)鍵因子以及達(dá)到從根本上緩解花生連作障礙的目標(biāo)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用盆栽試驗(yàn)，供試花生品種分別為魯花12號(hào)和花育25號(hào)，土壤采自青島市近十年未種植過花生的耕層土，過1 cm篩后混勻，選用高26 cm，內(nèi)徑36 cm的盆進(jìn)行試驗(yàn)，每盆裝土18 kg。每盆栽植2株，每個(gè)品種栽植20盆，連續(xù)種植三年。盆栽試驗(yàn)采用旱棚模式：整個(gè)種植過程中不施加任何肥料；澆水則完全用滅菌水澆灌；取樣深度為表層以下5～10 cm處?；ㄉ磕?月上旬種植，生育期130 d。每年收獲期，每個(gè)花生品種隨機(jī)選擇10盆，用直徑1.5 cm土鉆于表層以下5～10 cm根部處取土樣混勻，具體取樣方法參見Mingna Chen等[12]，采集的土壤樣品于-80 ℃冰箱備用。

1.2 土壤元素的測(cè)定與分析

兩個(gè)花生品種連作一年、兩年、三年的土壤樣品分別命名為L(zhǎng)12-1、H25-1、L12-2、H25-2、L12-3和H25-3，例如L12-1為魯花12連作一年的土壤，H25-1為花育25號(hào)連作一年的土壤。土壤樣品剔除其中的花生根系及殘?bào)w等雜物，經(jīng)自然風(fēng)干，研磨過篩備用。土壤pH值用水浸提電位法測(cè)定(水土比5:1)，pH計(jì)為HI2221型，有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，水解氮用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，速效磷用NaHCO3浸提—鉬藍(lán)比色法測(cè)定，速效鉀用乙酸銨浸提火焰光度法測(cè)定，全鹽量采用殘?jiān)|(zhì)量烘干法測(cè)定，有效硼、有效鐵、有效錳、有效銅、有效鋅、有效鉬采用ICP-OES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀法測(cè)定[13-14]。

1.3 土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)分析

采用16S rRNA和18S rRNA基因文庫(kù)構(gòu)建的方法對(duì)土壤中的細(xì)菌和真菌微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[12,15]。針對(duì)兩個(gè)不同花生品種連作一年、兩年、三年收獲期的根系土壤分別構(gòu)建了6個(gè)16S rRNA基因文庫(kù)(命名為L(zhǎng)12-B1、H25-B1、L12-B2、H25-B2、L12-B3和H25-B3)和6個(gè)18S rRNA基因文庫(kù)(命名為L(zhǎng)12-E1、H25-E1、L12-E2、H25-E2、L12-E3和H25-E3)。例如：L12-B1為魯花12號(hào)連作一年土壤的細(xì)菌文庫(kù)，L12-E1為魯花12號(hào)連作1年的真菌文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建后對(duì)所有測(cè)序序列的處理如Mingna Chen 等所述[13,15-16]。采用SPSS 18.0和Genesis program 1.7軟件對(duì)16S rRNA基因文庫(kù)和18S rRNA基因文庫(kù)的分類單元分別進(jìn)行聚類分析和熱圖(heatmap)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)連作三年花生根系土壤的pH值及營(yíng)養(yǎng)元素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析及方差分析。用雙因素方差分析(two-way ANOVA)檢驗(yàn)不同連作年限和不同花生品種根系土壤理化性質(zhì)的差異。使用R語(yǔ)言的Vegan軟件包分析不同連作年限花生根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異性及其與土壤理化因子之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作花生土壤理化性質(zhì)的變化特征分析

聚類分析表明，6個(gè)花生連作土壤樣品的理化性質(zhì)可以分為三簇，連作一年、兩年、三年的土壤樣品分別被歸為一類，其中連作兩年和連作三年的土壤理化性質(zhì)分類更為接近 (圖1)。

進(jìn)一步對(duì)不同連作年限花生根系土壤的pH和土壤元素含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，連作確實(shí)對(duì)土壤理化性質(zhì)影響顯著，但土壤pH及不同元素對(duì)連作的響應(yīng)存在差異(圖2)；部分土壤理化性質(zhì)也受花生品種的影響(表1)。土壤pH和有效磷、全鹽、有效鉀、有效錳、有效鐵、有效銅含量受連作年限影響顯著，連作兩年后指標(biāo)變化尤其顯著。魯花12和花育25連作1年、2年、3年土壤pH分別是7.20、7.60、7.49 和7.21、7.62和7.54，連作兩年比連作一年的pH有較大幅度提高，第三年的pH值又略有降低，兩個(gè)品種表現(xiàn)一致。土壤中有效磷和全鹽含量則隨著連作年限的增加顯著降低，連作兩年的降低幅度尤為顯著。兩個(gè)品種三年連作土壤的有效磷含量分別為79.1、49.17、45.90和75.57、55.93、47.27(mg/kg)；全鹽量分別為1.55、0.75、0.23和1.24、0.45、0.24(g/kg)?；ㄉB作一年根系土壤有效鉀、有效錳、有效鐵、有效銅的含量與連作兩年、三年土壤中的含量差異顯著，而連作兩年和連作三年土壤中的含量則差異不大(圖2)。另外，兩個(gè)品種根系土壤的水解氮、有效磷、有效硼含量和全鹽量差異顯著，其他土壤理化指標(biāo)品種間沒有顯著差異 (表1)。

圖1 花生連作土壤理化性質(zhì)聚類分析 Fig.1 Clustering analysis of physical and chemical properties of peanut continuous cropping soil

測(cè)定項(xiàng)目Items for testing平方和 Sum of squares均 方 Mean squareF 值F value p值 p value pH 0.0020 0.0020 0.1300 0.7249 有機(jī)質(zhì)Organic matter0.0021 0.0021 0.00000.9848水解氮 Hydrolyzable nitrogen 12.4991 12.4991 12.8260 0.0038??有效磷 Available phosphorus11.0450 11.0450 10.4140 0.0073??有效鉀 Available potassium15.4933 15.4933 0.35500.6117全鹽量 Total salt content0.1740 0.1740 114.3370 0.0001??有效錳 Available manganese0.1605 0.1605 0.49000.4974有效鉬 Available molybdenum0.0042 0.0042 2.83500.1180有效硼 Available boron0.0168 0.0168 21.45400.0006??有效鐵 Available iron0.0090 0.0090 0.00700.9394 有效銅 Available copper0.0038 0.0038 1.49200.2453 有效鋅 Available zinc0.0004 0.0004 0.10800.7485

注：**p<0.01。

圖2 不同連作年限花生根系土壤pH值及營(yíng)養(yǎng)元素含量 Fig.2 The pH value and element concentrations of peanut root soil under different continuous cropping period 注：圖中不同大寫字母表示不同連作年限土壤pH值和元素含量顯著差異程度(p<0.01)；圖中數(shù)據(jù)為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)。 Note: The different capital letters in the figure indicate the significant difference between soil pH and element content in different continuous cropping years (p<0.01); the data in the figure are mean ± standard error (n=3).

圖3 16S rRNA基因文庫(kù)OTUs的聚類分析 Fig.3 Clustering analysis of OTUs detected from 16S rRNA gene libraries

2.2 連作花生土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性分析

對(duì)6個(gè)土壤樣品16S rRNA基因文庫(kù)和6個(gè)樣本的18S rRNA基因文庫(kù)的分類單元分別進(jìn)行了聚類分析和熱圖分析。結(jié)果表明，花生連作對(duì)根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著影響，6個(gè)細(xì)菌文庫(kù)和6個(gè)真菌文庫(kù)的聚類結(jié)果一致，連作一年、兩年、三年的土壤微生物文庫(kù)分別被聚為一類，連作兩年與連作三年的土壤文庫(kù)聚類距離更為接近。表明花生根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)確實(shí)受連作影響，而且對(duì)不同連作年限的響應(yīng)存在差異，受花生品種影響較小。對(duì)比連作花生根系土壤細(xì)菌、真菌群落的聚類分析和土壤理化指標(biāo)的聚類分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)聚類規(guī)律一致，即無(wú)論是不同花生品種微生物群落的聚類還是土壤理化指標(biāo)的聚類，都是連作相同年限的土壤各聚為一類，且連作兩年與連作三年的土壤聚類距離更接近(圖1、圖3、圖4)。

圖4 18S rRNA基因文庫(kù)真菌類群的熱圖分析 Fig.4 Heatmap analysis of the fungal orders or phylotypes detected in the 18S rRNA gene libraries

圖5 土壤微生物群落與土壤元素的關(guān)聯(lián)分析 Fig.5 Correlation analyses on soil microbial communities and soil elements 注：Y1，Y2，Y3分別代表連作1年、2年、3年，A為土壤元素與16S rRNA基因文庫(kù)的聯(lián)合分析，B為土壤元素與18S rRNA基因文庫(kù)的聯(lián)合分析。Note: Y1, Y2, and Y3 represent continuous cropping for 1 year, 2 years, and 3 years, respectively. A is a collection analysis of soil elements and 16S rRNA gene library sequences, and B is a collection analysis of soil elements and 18S rRNA gene library sequences.

另外，選取受連作影響顯著的全鹽和四種土壤營(yíng)養(yǎng)元素(有效磷、有效鉀、有效錳和有效銅)與連作過程中的土壤細(xì)菌群落和真菌群落分別進(jìn)行典型相關(guān)分析(Canonical Correlation Analyses，CCA)結(jié)果表明，連作一年、兩年、三年的根系土壤微生物群落分別被歸為一類，全鹽量和有效銅的含量與連作兩年、三年土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性強(qiáng)，而有效鉀、有效磷、有效錳的含量與連作一年的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性強(qiáng)(圖5)。

3 討論與結(jié)論

花生根系土壤的理化性質(zhì)受連作年限影響。黃玉茜[7]發(fā)現(xiàn)土壤中全氮含量、堿解氮含量隨著花生連作年限的增加總體呈先增后降再增的趨勢(shì)，而全磷、有效鉀含量則伴隨連作呈下降趨勢(shì)，有效 Fe、Cu、Zn的含量均隨連作呈逐年下降的趨勢(shì)。封海勝等[6]對(duì)中等肥力砂壤土連作花生的研究表明，土壤中速效磷、速效鉀和速效硼的含量隨連作年限的增加而減少，土壤中三者的含量在連作三年的土壤中較輪作土壤中分別減少了52.9%、40.6%和53.8%，而水解氮含量變化不大。本文對(duì)兩個(gè)不同花生品種連作一年、兩年、三年的土壤pH值以及11個(gè)常量、微量營(yíng)養(yǎng)元素含量進(jìn)行分析，聚類分析結(jié)果表明連作一年、兩年、三年的土壤樣品分別被歸為一類，其中連作兩年和連作三年的土壤理化性質(zhì)更為接近。三年連作過程中，pH值先有較大幅度升高而后略有降低，全鹽量以及有效磷、有效鉀、有效錳、有效鐵、有效銅的含量受連作影響顯著，其中全鹽量和有效磷含量隨連作年限增加而逐年降低，連作兩年土壤中的有效鉀、有效錳、有效鐵、有效銅的含量比連作一年的土壤顯著降低，而與連作三年土壤中的含量差異不大。另外，根系土壤的水解氮、有效磷、有效硼含量和全鹽量還受品種影響顯著。

綜上所述，連作確實(shí)造成花生根系土壤營(yíng)養(yǎng)元素失衡，長(zhǎng)期連作和短期連作對(duì)花生根系土壤pH值及元素含量的影響效力不同，并且不同理化指標(biāo)對(duì)連作年限以及品種的響應(yīng)也有所差異。

對(duì)兩個(gè)花生品種連作一年、兩年、三年的根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，連作對(duì)土壤微生物群落的影響規(guī)律與對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響規(guī)律一致，連作一年、兩年、三年的花生根系土壤微生物群落存在顯著差異，并且，連作兩年與連作三年的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)更為相似。近年來(lái)，對(duì)連作花生土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究越來(lái)越多，研究證實(shí)連作確實(shí)造成花生根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，土壤及根際真菌的數(shù)量隨花生連作年限的增加而顯著增加，細(xì)菌和放線菌數(shù)量則明顯減少[16-17]。我們前期對(duì)花生連作過程中土壤微生物群落演替規(guī)律的研究結(jié)果也表明花生連作致使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，病原微生物尤其是真菌性病原菌的豐度和多樣性增加，而有益微生物則呈減少趨勢(shì)[12,15]。但目前，對(duì)花生連作過程中根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性研究還很少。本研究證實(shí)花生連作過程中根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化確實(shí)與土壤理化性質(zhì)的變化存在密切相關(guān)性，并且兩者變化趨勢(shì)對(duì)連作年限的響應(yīng)一致。對(duì)連作過程中含量變化顯著的土壤元素進(jìn)一步與土壤細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明全鹽量和有效銅的含量與連作兩年、三年土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性強(qiáng)，而有效鉀、有效磷、有效錳的含量與連作一年的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性強(qiáng)，推測(cè)這些元素與土壤微生物的生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)，由于花生對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的偏好性，使連作過程中土壤營(yíng)養(yǎng)元素失衡，進(jìn)而影響了根系微生物的生長(zhǎng)代謝，從而使根系微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致花生的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響。

本研究分析了花生連作過程中土壤理化性質(zhì)包括pH值和土壤常量、微量元素的變化特征和連作過程中花生根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征及其與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，花生根系土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)確實(shí)受連作影響，而受花生品種影響較小。兩者對(duì)連作年限的響應(yīng)規(guī)律一致，連作一年的土壤與連作兩年、三年的土壤差異更為顯著；并且連作過程中根系土壤理化性質(zhì)的變化與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化具有顯著相關(guān)性。