腫瘤標(biāo)本庫(kù)建設(shè)研究進(jìn)展

馬紀(jì)，王劍松，顏汝平，王海峰

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科一病區(qū)，云南　昆明　650101）

從上個(gè)世紀(jì)后半期以來(lái)，在全球范圍內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率均呈顯著上升趨勢(shì)，尤其在60、70年代后，癌癥發(fā)病數(shù)以年均3%～5%的速度增長(zhǎng)，成為了人類死亡的主要原因之一。根據(jù)WHO提供的數(shù)據(jù)，大約每年有1 000萬(wàn)被新診斷為惡性腫瘤患者，并且其中絕大部分出現(xiàn)在發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)自改革開放以來(lái)，社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境以及生活方式發(fā)生了很大的改變，老齡化程度越發(fā)嚴(yán)重。目前，我國(guó)已成為惡性腫瘤新發(fā)病例最多的國(guó)家之一，這必將對(duì)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)以及家庭產(chǎn)生重要影響。腫瘤防治已成為重要的公共健康問(wèn)題。因此惡性腫瘤的研究也已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。通過(guò)近年來(lái)的不斷努力，研究方法以及相關(guān)研究設(shè)備的改進(jìn)，對(duì)惡性腫瘤研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。但是惡性腫瘤的研究面臨著腫瘤標(biāo)本等研究資料的相對(duì)匱乏，可重復(fù)性弱，研究進(jìn)程較慢等。研究人員可以通過(guò)腫瘤組織、血液、尿液等相關(guān)標(biāo)本，進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室研究，譬如腫瘤發(fā)病機(jī)制、特異性抗原篩選，靶向藥物研發(fā)等，從而獲得大量的信息。然而各大醫(yī)療機(jī)構(gòu)在臨床工作中產(chǎn)生的大量腫瘤標(biāo)本由于缺乏系統(tǒng)地收集管理，對(duì)實(shí)驗(yàn)室研究而言珍貴的研究素材—腫瘤標(biāo)本白白浪費(fèi)。如何將珍貴而有限的人類惡性腫瘤資源收集并將其充分利用于腫瘤的研究，人們找到了科學(xué)合理的解決方法。

從二十世紀(jì)末期開始，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家興起了標(biāo)準(zhǔn)化腫瘤標(biāo)本庫(kù)的創(chuàng)建，例如奧地利基因組織庫(kù)建立于1983年，目前已儲(chǔ)存百萬(wàn)例病變或者正常的組織，美國(guó)MD癌癥中心較早建立了頭頸外科腫瘤標(biāo)本庫(kù)和胰腺腫瘤組織庫(kù)[1]，儲(chǔ)存相關(guān)惡性腫瘤標(biāo)本、癌旁組織、正常組織達(dá)萬(wàn)例；2000年，華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心等研究機(jī)構(gòu)成立了前列腺癌合作單位，收集了數(shù)千例前列腺癌標(biāo)本[2]。國(guó)內(nèi)最早開始進(jìn)行腫瘤標(biāo)本庫(kù)建設(shè)的機(jī)構(gòu)是北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院，于1996年建庫(kù)，收集了常見普外科腫瘤組織、腫瘤患者血清標(biāo)本等[3]。目前國(guó)內(nèi)外各大高校與科研機(jī)構(gòu)，先后建立起了多病種的腫瘤組織庫(kù)或側(cè)重于某一研究領(lǐng)域?qū)ｉT的標(biāo)本庫(kù)，并予以配套了相關(guān)的采集、保存、日常管理以及臨床流行病學(xué)等資料收集的規(guī)范[4-6]。對(duì)于相關(guān)標(biāo)本庫(kù)的創(chuàng)建、管理、維護(hù)、使用等相關(guān)問(wèn)題。我們做了一些相應(yīng)的資料進(jìn)行收集、研究和分析，現(xiàn)綜述如下。

1　收集前注意事項(xiàng)

根據(jù)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求的人體組織相關(guān)的科學(xué)研究的規(guī)范，應(yīng)當(dāng)對(duì)患者及家屬告知情況，征得同意：需在術(shù)中切取標(biāo)本，并簽署術(shù)中留取標(biāo)本協(xié)議書。術(shù)前與病理科協(xié)商，在保證病理檢查前提下，收集少量組織入標(biāo)本庫(kù)儲(chǔ)存，標(biāo)本體積較小或難以分辨時(shí)應(yīng)當(dāng)立即放棄。無(wú)論是收集或是使用標(biāo)本，都應(yīng)當(dāng)獲取倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[3]。

2　場(chǎng)地、設(shè)備、信息管理系統(tǒng)及相關(guān)規(guī)程

腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)的建立和管理需要醫(yī)院相關(guān)管理部門、臨床科室、病理科及實(shí)驗(yàn)室的協(xié)助和參與，應(yīng)當(dāng)有科學(xué)合理的建庫(kù)條件，且合理布局。在醫(yī)院手術(shù)室設(shè)立標(biāo)本采樣間，包括組織取材的工具如，手術(shù)刀、精細(xì)剪、鑷子、無(wú)菌手套等，為保證取材流程無(wú)菌狀態(tài)，取材工具應(yīng)當(dāng)常規(guī)消毒，并進(jìn)行相應(yīng)包裝保存。血液標(biāo)本采集裝備：離心管、吸管、采血管、保存盒等。臨時(shí)運(yùn)輸保存設(shè)備：如小容量液氮罐；在實(shí)驗(yàn)室設(shè)有專業(yè)的庫(kù)房，應(yīng)當(dāng)合理布局：大型液氮罐、-80℃超低溫冰箱，并連接溫度監(jiān)控報(bào)警系統(tǒng)。制定相應(yīng)的應(yīng)急預(yù)案，需專門的管理人員負(fù)責(zé)庫(kù)房管理，如遇停電等能及時(shí)將標(biāo)本轉(zhuǎn)移出超低溫冰箱至液氮罐；對(duì)火災(zāi)及其他突發(fā)情況也應(yīng)有相應(yīng)應(yīng)急預(yù)案。對(duì)標(biāo)本后期研究及質(zhì)量控制管理，還需要專業(yè)設(shè)備儀器，如：紫外分光光度計(jì)、電泳儀、高速離心機(jī)、基因擴(kuò)增儀及其滅菌設(shè)備等[3]。相應(yīng)管理工作還需配備相應(yīng)的電腦、打印機(jī)、相機(jī)等。日常管理：工作人員出入采樣間或庫(kù)房須佩戴一次性口罩帽子，穿隔離衣，采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)當(dāng)遵守手術(shù)室無(wú)菌操作原則，所有器械和凍存管使用前應(yīng)當(dāng)消毒，避免對(duì)標(biāo)本組織產(chǎn)生干擾。標(biāo)本的儲(chǔ)存應(yīng)當(dāng)分為多份，避免反復(fù)凍融，影響標(biāo)本質(zhì)量。信息管理系統(tǒng)：標(biāo)本庫(kù)的管理系統(tǒng)與醫(yī)院臨床、病理、影像科室及實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)進(jìn)行一定程度信息共享，并且制定相關(guān)的臨床科室、倫理委員會(huì)的申請(qǐng)查詢、審批制度。制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程：醫(yī)院臨床工作流程中增加相應(yīng)的與標(biāo)本庫(kù)建設(shè)相關(guān)的流程：如相應(yīng)手術(shù)術(shù)后常規(guī)按規(guī)程采集標(biāo)本，入庫(kù)、登記等。

3　標(biāo)本的采集與保存

制定嚴(yán)格的操作規(guī)范：手術(shù)室內(nèi)配備專人進(jìn)行腫瘤標(biāo)本采集，并且制定相關(guān)的操作規(guī)范，技術(shù)要求。

3.1腫瘤標(biāo)本組織的收集[7]首先腫瘤的離體與收集應(yīng)當(dāng)在相應(yīng)的無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，術(shù)中由外科醫(yī)生切除腫瘤組織及相關(guān)器官后，采集者應(yīng)當(dāng)確定腫瘤組織、腫瘤旁組織和切緣遠(yuǎn)端非腫瘤組織的區(qū)分。比如取材時(shí)應(yīng)注意腫瘤組織的數(shù)目、大小、形態(tài)、顏色、硬度，明確區(qū)分腫瘤組織與非腫瘤組織，保證取材質(zhì)量；并且保證標(biāo)本采集后的殘存組織能夠不影響術(shù)后病理診斷，避免不必要的醫(yī)療糾紛，腫瘤組織體積明顯較小則不宜取。若腫瘤標(biāo)本符合取材條件，則應(yīng)適當(dāng)分離腫瘤與腫瘤旁組織，并測(cè)量其大小，照片存檔[8]；使用專門手術(shù)器械（應(yīng)嚴(yán)格消毒）分別切取腫瘤組織、腫瘤旁組織（距離腫瘤組織2 cm的組織）和切緣遠(yuǎn)端非腫瘤組織（距離腫瘤組織＞5 cm的組織）各數(shù)份。切取的腫瘤組織塊大小一般為：0.3～0.5 ml，切取數(shù)塊，有利于減少凍溶循環(huán)頻率且冷凍速度快[9]。快速分類后，裝入凍存管內(nèi)，標(biāo)本的保存首先根據(jù)科研機(jī)構(gòu)及醫(yī)院各個(gè)課題組的要求條件保存，例如：冰凍標(biāo)本則直接轉(zhuǎn)入液氮罐或-80℃冰箱內(nèi)。石蠟標(biāo)本[10]則予以10%福爾馬林固定后，進(jìn)行石蠟包埋。腫瘤組織在離體后一段時(shí)間內(nèi)會(huì)有因缺血原因造成的mRNA降解，對(duì)其蛋白質(zhì)的表達(dá)和磷酸化水平會(huì)有一定程度的影響[11]。目前普遍認(rèn)可的觀點(diǎn)是采集并轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程時(shí)間應(yīng)當(dāng)保證在腫瘤標(biāo)本或者該器官組織切除離體后15 min內(nèi)（最長(zhǎng)不應(yīng)當(dāng)超過(guò)半小時(shí)）[12]，也有學(xué)者建議離體2 h內(nèi)的標(biāo)本也可收集。日常實(shí)踐時(shí)，由于手術(shù)相關(guān)情況，組織血供已斷，缺血時(shí)未能及時(shí)取出標(biāo)本，或術(shù)后需將完整標(biāo)本照相或給家屬看等，未能在規(guī)定時(shí)間取出標(biāo)本，因此也會(huì)造成部分標(biāo)本質(zhì)量下降。為了增加腫瘤標(biāo)本收集效率，標(biāo)本切除后2 h以內(nèi)的標(biāo)本通常也有收集。收集后應(yīng)記錄標(biāo)本相關(guān)信息，如：標(biāo)本離體時(shí)間，存入凍存管編號(hào)，標(biāo)本種類，器官或組織類型，液氮罐或超低溫冰箱內(nèi)擺放位置。

3.2其他標(biāo)本的收集

（1）尿液：取得病人及其家屬的同意后，用開口較大容器收集（容量一般大于20 ml）。建議采集中段尿，并且應(yīng)當(dāng)避免陰道分泌物、月經(jīng)等污染，加入甲醛或甲苯等防腐劑后，冷藏于4℃冰箱內(nèi)。具體采集有：①隨機(jī)尿：較適合細(xì)胞性研究；②晨尿：比較適合檢測(cè)尿液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞等濃縮物質(zhì)。

（2）血液標(biāo)本：對(duì)于入院治療患者（手術(shù)、化療、放療）可以將抽血時(shí)間分為數(shù)次：入院后第1天抽血、治療后當(dāng)天、術(shù)后不同時(shí)段等。采集數(shù)量一般為5～10 ml，血樣分成兩份標(biāo)本：一份不抗凝，離心后，吸取上層血清，按照一定規(guī)格分裝，最后置入-80℃冰箱或液氮罐中（多作蛋白質(zhì)相關(guān)研究）；另一份加入抗凝劑及淋巴細(xì)胞分離液，后離心分離有核細(xì)胞，抽取后置無(wú)菌Ep管中（可做DNA、RNA提取及其它相關(guān)研究），向其中加入RNAlater保存液，分裝后同樣置入-80℃冰箱或液氮罐。存入的標(biāo)本行相關(guān)信息采集，做好登記，避免抽取血液標(biāo)本后等待時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞mRNA、蛋白質(zhì)降解，應(yīng)當(dāng)在采血后快速保存。

4　標(biāo)本的質(zhì)控與抽查

標(biāo)本采集、運(yùn)輸、使用過(guò)程中可能由于操作不當(dāng)或者因?yàn)闃?biāo)本本身成分混雜，壞死、炎性組織太多，需要的腫瘤組織過(guò)少或者保存中設(shè)備異?；蚴褂貌划?dāng)，導(dǎo)致標(biāo)本質(zhì)量下降。質(zhì)量控制是指在腫瘤標(biāo)本庫(kù)日常運(yùn)行過(guò)程中，在采集，轉(zhuǎn)運(yùn)，保存、信息記錄、儀器設(shè)備檢查維護(hù)等相關(guān)流程里，規(guī)范操作，且控制組織樣本質(zhì)量，剔除其中不合格樣品，為了使其能夠較好地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究。對(duì)于腫瘤組織、血液等標(biāo)本要避其DNA、RNA和蛋白的降解，保證其質(zhì)量合格，因此應(yīng)當(dāng)在日常管理流程中制定有利于標(biāo)本檢測(cè)的制度，首先是建立標(biāo)本使用者的信息反饋制度，根據(jù)其使用情況，對(duì)標(biāo)本的質(zhì)量有一定程度的了解，其次在收集標(biāo)本組織（腫瘤、癌旁組織）時(shí)應(yīng)當(dāng)同時(shí)收集多份，在其中存留1～2份已被后期質(zhì)量控制分析使用。研究表明DNA不易降解，質(zhì)控的難點(diǎn)在于RNA的保存，對(duì)腫瘤標(biāo)本庫(kù)內(nèi)標(biāo)本進(jìn)行定期隨機(jī)抽樣調(diào)查，主要是針對(duì)RNA，具體操作簡(jiǎn)述為[12-13]：對(duì)抽樣標(biāo)本的備用份行總RNA進(jìn)行提取，并對(duì)其予以紫外分光光度計(jì)分析，分析結(jié)果若A260/A280＞1.6，后行1%瓊脂糖凝膠電泳，如若可見28 s和18 s條帶，且前者的亮度能夠達(dá)到是后者的1～2倍，則表明腫瘤組織RNA未被降解，其質(zhì)量合格并可以運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)研究。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)樣本RNA質(zhì)量和完整性存在著較大影響，腫瘤組織離體時(shí)間越短，采集后組織RNA的降解越少，其保存完整性越高。

5　　構(gòu)建病例隨訪平臺(tái)

與患者溝通，取得其同意后，將其納入隨訪平臺(tái)中，對(duì)應(yīng)每一個(gè)采集的標(biāo)本的患者，針對(duì)其病情制定與之相匹配的隨訪方案，目的在于可以為一些前瞻性臨床研究留下相關(guān)資料，便于觀察患者疾病的發(fā)生、進(jìn)展等?？梢詫?duì)患者動(dòng)態(tài)管理，且臨床資料能夠動(dòng)態(tài)收集。對(duì)于該平臺(tái)數(shù)據(jù)錄入方面，應(yīng)當(dāng)包括患者的一般信息（姓名、年齡、性別、聯(lián)系方式、家庭住址、住院時(shí)間、住院號(hào)等）、臨床資料（包括臨床診斷、病理、影像資料、相關(guān)病例、病程資料等）、隨訪記錄、術(shù)后恢復(fù)情況、并發(fā)疾病情況、術(shù)后復(fù)發(fā)及疾病進(jìn)展情況、死亡原因和死亡日期等。

6　標(biāo)本信息庫(kù)運(yùn)作流程

惡性腫瘤標(biāo)本庫(kù)的建立比較重要的一個(gè)環(huán)節(jié)是建立一個(gè)與之匹配信息管理系統(tǒng)，可以滿足標(biāo)本庫(kù)日常運(yùn)作所需的信息錄入、儲(chǔ)存、查詢等功能，若條件允許，則應(yīng)與醫(yī)院及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)聯(lián)，能夠進(jìn)行臨床病理、影像學(xué)資料、實(shí)驗(yàn)室相關(guān)數(shù)據(jù)的鏈接。具體操作如下：首先是患者一般信息及臨床資料的錄入[14]：姓名、性別、年齡、出生地、住院號(hào)、臨床診斷等；腫瘤標(biāo)本信息錄入：包括入庫(kù)編號(hào)、收集時(shí)間、入庫(kù)時(shí)間、標(biāo)本類型、取材器官、凍存方法等；標(biāo)本存放信息：相應(yīng)的液氮罐或-80℃超低溫冰箱編號(hào)、存放架編號(hào)、存放坐標(biāo)、凍存管規(guī)格型號(hào)、標(biāo)本數(shù)量等；標(biāo)本使用管理[15]：出庫(kù)時(shí)間、使用相關(guān)課題或用途、使用者、使用數(shù)量、出庫(kù)辦理人員等；標(biāo)本廢除信息：入庫(kù)編號(hào)、存放架編號(hào)、廢除日期及其廢除原因；信息查詢功能：包括數(shù)據(jù)導(dǎo)入、導(dǎo)出、查詢、統(tǒng)計(jì)等；出庫(kù)登記：管理人員嚴(yán)格按照標(biāo)本庫(kù)制定的標(biāo)本入、出庫(kù)程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化管理，標(biāo)本使用需申請(qǐng)，經(jīng)醫(yī)院主管人員和腫瘤庫(kù)負(fù)責(zé)人審批后行標(biāo)本出庫(kù)登記。

7　標(biāo)本庫(kù)相關(guān)倫理法律問(wèn)題

患者是腫瘤組織的所有者，標(biāo)本庫(kù)的建立設(shè)計(jì)了活體組織的收集、保存和使用涉及到倫理學(xué)及法律的部分問(wèn)題，《侵權(quán)責(zé)任法》規(guī)定，應(yīng)當(dāng)保證患者的知情權(quán)和自主權(quán)，因此在收集標(biāo)本前應(yīng)簽署相關(guān)文書，并且保證患者在收集、保存、使用、信息采集的過(guò)程中有撤銷同意的權(quán)利。使用時(shí)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相應(yīng)單位的審批程序，并且在此過(guò)程中保護(hù)患者隱私，維護(hù)其利益。也有一些研究機(jī)構(gòu)認(rèn)為患者捐獻(xiàn)標(biāo)本有一定商業(yè)價(jià)值，應(yīng)當(dāng)予以。而且對(duì)標(biāo)本使用嚴(yán)格把關(guān)，相關(guān)研究應(yīng)當(dāng)是正當(dāng)?shù)目茖W(xué)研究，有利于大眾，符合倫理學(xué)要求。

8　結(jié)語(yǔ)及展望

隨著人口老齡化的不斷發(fā)展，腫瘤的高發(fā)，其研究成為醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。雖然近幾十年來(lái)，隨著研究相關(guān)設(shè)備的不斷改進(jìn)，研究方法的不斷創(chuàng)新，腫瘤相關(guān)研究已經(jīng)有了較快發(fā)展和比較豐碩的成果。此時(shí)作為惡性腫瘤研究材料的腫瘤組織標(biāo)本在促進(jìn)腫瘤研究進(jìn)展過(guò)程中就扮演了重要的角色，成為了腫瘤研究工作的重要支撐。腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)的建立為研究提供高質(zhì)量標(biāo)本，一定程度上解決研究的重復(fù)性較差，研究周期長(zhǎng)，進(jìn)程較慢的問(wèn)題；目前腫瘤標(biāo)本庫(kù)的建立及管理尚處于起步階段，還有許多不足之處：①與國(guó)外大型腫瘤標(biāo)本庫(kù)相比，國(guó)內(nèi)的明顯規(guī)模較小，且缺乏統(tǒng)一管理和信息互通；②對(duì)于建立兒童腫瘤標(biāo)本庫(kù)的報(bào)道甚少，標(biāo)本庫(kù)數(shù)據(jù)源獨(dú)立，尚未提供與醫(yī)院病案信息系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查信息系統(tǒng)等的數(shù)據(jù)接口；③信息化滯后，無(wú)法形成各大醫(yī)院、科研機(jī)構(gòu)之間大數(shù)據(jù)共享，有賴于醫(yī)院信息管理水平的提高，加大對(duì)腫瘤標(biāo)本庫(kù)的重視度，以及各單位、地區(qū)之間的進(jìn)一步協(xié)作。

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