豬繁殖與呼吸綜合征病毒樣顆粒疫苗研究進(jìn)展

吳憶春

(濱州職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東濱州 256603)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)能引起豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，PRRS是一種高度接觸傳染的豬傳染病[1]。臨床主要表現(xiàn)為母豬發(fā)熱、厭食及妊娠豬發(fā)生繁殖障礙性疾病如后期流產(chǎn)、返情、產(chǎn)弱仔及木乃伊胎，各種年齡豬嚴(yán)重呼吸道疾病[2]，發(fā)病率和病死率高。PRRS是一種免疫抑制病，損害豬免疫機(jī)能，易繼發(fā)其他復(fù)雜的豬病。1987年，PRRS首次在美國發(fā)生[3]，1991年，荷蘭學(xué)者首先分離到PRRSV[4]，隨后，在世界各地廣泛流行，僅澳大利亞、瑞典、挪威等少數(shù)國家沒有該病[5]。PRRS對(duì)當(dāng)前世界養(yǎng)豬的危害十分嚴(yán)重。我國的第1株P(guān)RRSV于1996年由郭寶清分離。2006年，我國暴發(fā)了高致病性PRRS。2012年，周峰等率先報(bào)道成功分離出高度變異的類NADC30 PRRSV 毒株，該毒株毒力較高致病性毒株稍弱，但該毒株非常容易與其他毒株重組，并在我國多個(gè)地區(qū)流行，現(xiàn)有疫苗不能對(duì)該毒株提供有效的保護(hù)[6-7]，使PRRS的防控工作更加復(fù)雜。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定PRRS是一種必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病[8]，我國將高致病性豬藍(lán)耳病列為一類動(dòng)物傳染病。PRRSV可分為2個(gè)基因型，即美洲型和歐洲型[9]，代表毒株分別是VR-2332和LV株。2種基因型之間核苷酸序列的同源性很低，大約60%左右。二者引起的豬臨床癥狀和病變類似，但沒有交叉保護(hù)性，也不會(huì)發(fā)生基因重組。我國PRRS主要流行的基因型為美州型，近年來歐洲型PRRS感染增多。PRRSV很容易發(fā)生變異，不同美洲型病毒很容易發(fā)生重組，產(chǎn)生新的病毒株。不同PRRSV毒株對(duì)豬的致病性不同，同一PRRSV毒株對(duì)不同豬的毒力不一。

豬是PRRSV的唯一自然宿主，潛伏期最長(zhǎng)的37 d，最短的3 d。各品種和日齡豬均可感染發(fā)病，妊娠豬和未斷奶仔豬受到的危害最為嚴(yán)重。本病傳染源是病豬和帶毒豬，可經(jīng)水平傳播和垂直傳播兩種途徑傳播。病毒可通過唾液、鼻液、糞便、尿液、乳汁等排出體外[10]，污染飼料、飲水等，通過呼吸道、消化道等傳播，病毒可通過空氣傳播9 km，公豬能通過精液感染母豬，公豬精液排毒為間斷性排毒，有時(shí)豬病毒血癥消失后仍然能排毒，最長(zhǎng)排毒時(shí)間可達(dá)3個(gè)月。母豬能將病毒傳給仔豬，致仔豬帶毒、排毒。

1 病毒基本信息

PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬[11]，病毒粒子呈球型，直徑55 nm～60 nm，有囊膜，表面有纖突。病毒核衣殼呈20面立體對(duì)稱，內(nèi)含單股線狀正鏈RNA[12]，基因組全長(zhǎng)約15kb，包括9個(gè)開放閱讀框架(open reading framework，ORF)，即ORFla、ORFlb、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7[13]，編碼16個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[14]。ORF1a、ORF1b主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，約占整個(gè)PRRSV基因組全長(zhǎng)的的80%左右，經(jīng)蛋白酶裂解后可產(chǎn)生14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，其中NSP2的氨基酸序列在各毒株間差別最大。其余ORF均編碼結(jié)構(gòu)蛋白，其中最容易出現(xiàn)變異的基因是ORF3和ORF5?；贠RF5基因，PRRSV美州型被分為8個(gè)不同的譜系，我國主要流行的是譜系1(類NADC30)、3(類QYYZ)、5(類V2332)、8.3(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)。不同譜系可重組，譜系間基因同源性低，譜系內(nèi)同源性不一，譜系1最低，譜系5、8.3較高。其中ORF5、ORF3、ORF6和ORF7基因在免疫原性方面研究的比較深入。其中ORF5基因編碼GP5蛋白，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，免疫原性好[15]，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并對(duì)病毒的持續(xù)感染具有重要作用[16]。ORF6可編碼膜基質(zhì)蛋白M蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，與細(xì)胞免疫有關(guān)。PRRSV對(duì)外界環(huán)境抵抗力弱，37℃ 12 h病毒死亡一半，48 h后病毒可全部死亡，56℃ 病毒喪失感染性。病毒在干燥環(huán)境也能很快失活，低劑量乙醚和氯仿等常用消毒劑可迅速殺滅病毒。病毒適宜存活的pH范圍是6.5～7.5，超出此范圍病毒也可迅速滅活。PRRSV具有專嗜巨噬細(xì)胞的特性，不能凝集紅細(xì)胞。PRRS中和抗體水平較低時(shí)能促進(jìn)病毒的增殖，甚至促使已經(jīng)致弱的疫苗毒毒力返強(qiáng)的特性，也稱為抗體依賴的感染增強(qiáng)作用(antibody dependent enhancement，ADE)效應(yīng)，給PRRS的防控造成了困難。PRRSV具有持續(xù)性感染的特性，豬群一旦感染，很難根除，PRRSV在豬體長(zhǎng)期存在，豬只沒有明顯的臨床癥狀，并在豬群免疫力低下的時(shí)候不定期排毒。但是PRRSV并不能在豬體內(nèi)終生存在，最多可持續(xù)存在250天，可采取封群并配合相應(yīng)疫苗免疫的方法獲得PRRS陰性豬場(chǎng)。

2 病毒樣顆粒

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是由體外表達(dá)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白(一種或幾種)自行組裝成的一種空心蛋白顆粒[17]。外觀與天然病毒粒子類似，內(nèi)部無核酸，不能增值，無致病性。直徑約20 nm～150 nm[18]，具有很好的免疫原性[19]，免疫劑量小，免疫后能誘導(dǎo)體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫?？蓪LPs制成一種亞單位疫苗，可通過一定的檢測(cè)方法區(qū)分疫苗免疫和自然感染產(chǎn)生的抗體。20世紀(jì)80年代專家學(xué)者開始研究VLPs，迄今為止，已經(jīng)研制了近40種病毒的的VLPs，如黃病毒科病毒、細(xì)小病毒科病毒、杯狀病毒科病毒、圓環(huán)病毒科病毒、小RNA病毒科病毒、乙型肝炎病毒、呼腸病毒科病毒、新城疫病毒、人免疫缺陷病毒、傳染性法氏囊病毒、流感病毒等。VLPs的正確組裝受到多種理化因素的影響，如蛋白濃度、pH、離子強(qiáng)度和溫度等。VLPs模擬病毒粒子天然構(gòu)象，表面存在高度重復(fù)序列，容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別。

體外制備表達(dá)VLPs的系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)[20]，主要是將病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因克隆到相應(yīng)的載體中，構(gòu)建重組載體，再將其轉(zhuǎn)化原核表達(dá)用菌種，或通過脂質(zhì)體等介導(dǎo)轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，使外源重組蛋白高效表達(dá)，蛋白可自行組裝成VLPs。目前采用的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)有4類，分別是酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和植物表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)是相對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)來說，優(yōu)點(diǎn)是原理、操作均簡(jiǎn)單，成本不高，缺點(diǎn)是不能正確修飾所表達(dá)目的蛋白，因表達(dá)的蛋白量大，往往包涵體形式存在，不利于VLPs的正確組裝，僅適用于表達(dá)少數(shù)無囊膜病毒單個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白制備VLPs，對(duì)無囊膜病毒多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VLPs的制備，如呼腸病毒科病毒需要選擇真核表達(dá)系統(tǒng)。2011年，我國自主研制的由大腸桿菌制備戊型肝炎VLPs疫苗正式批準(zhǔn)生產(chǎn)，這是全球第一個(gè)戊肝疫苗，免疫效果良好，并具有很好的安全性。普萊柯生物和青島易邦分別采用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)制備了豬圓環(huán)病毒VLPs。真核表達(dá)系統(tǒng)適用范圍廣，對(duì)病毒是否存在囊膜制備VLPs時(shí)無明顯差別。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的表達(dá)系統(tǒng)，其主要優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)表達(dá)多種蛋白，且能對(duì)蛋白加工修飾，促使蛋白成熟，變?yōu)橛猩锘钚缘鞍祝忠驐U狀病毒不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，所以安全性很好。2000年，德國拜爾公司和美國默克公司分別用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研制了豬瘟病毒VLPs。勃林格、默克公司、先靈葆雅和武漢中博分別用桿狀病毒系統(tǒng)研制了PCV2 VLPs疫苗。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能很好地對(duì)表達(dá)后的蛋白加工修飾，保持蛋白的天然構(gòu)象和活性，但該系統(tǒng)多依賴質(zhì)粒而非病毒表達(dá)，蛋白表達(dá)所需時(shí)間長(zhǎng)，表達(dá)的蛋白量低，工藝復(fù)雜，價(jià)格昂貴，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。酵母表達(dá)系統(tǒng)主要還是用于制備無囊膜病毒的VLPs，釀酒酵母和畢赤酵母是常選用的宿主菌。也能對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行簡(jiǎn)單修飾，蛋白表達(dá)量大，成本低，但因酵母細(xì)胞壁厚，表達(dá)的VLPs很難分泌出來，更適合無囊膜病毒VLPs的研制。1986年，默克公司研發(fā)了世界上第一個(gè)基因工程疫苗乙型肝炎病毒VLPs疫苗，它由釀酒酵母系統(tǒng)表達(dá)制備，顆粒直徑約22 nm左右，接種該疫苗后，90%的人產(chǎn)生了特異性乙肝抗體。2006年，葛蘭素史克公司用桿狀病毒系統(tǒng)研制了人乳頭瘤病毒(HPV)VLPs，默克公司則用啤酒酵母表達(dá)系統(tǒng)研制了HPV VLPs疫苗，獲批上市，用于宮頸癌的預(yù)防，臨床應(yīng)用顯示，其效果良好。植物表達(dá)系統(tǒng)常用于表達(dá)外源蛋白的植物有煙草、苜蓿、馬鈴薯、菠菜及擬南芥等，可對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，該系統(tǒng)可大量制備無囊膜和有囊膜病毒的VLPs，生產(chǎn)成本低。

3 豬繁殖與呼吸綜合征商品化疫苗

目前，對(duì)發(fā)生PRRS的豬場(chǎng)，沒有十分有效的治療措施。豬場(chǎng)主要是通過對(duì)健康豬只接種疫苗進(jìn)行預(yù)防PRRS。所用的商品化疫苗主要還是傳統(tǒng)的全病毒抗原疫苗，包括滅活疫苗和弱毒活疫苗。滅活疫苗是對(duì)培養(yǎng)的PRRSV進(jìn)行滅活，加入一定比例的佐劑制備而成，適合種豬使用。通常需要注射兩次以上，且抗原含量足的情況下，才能產(chǎn)生足夠的抗體，滅活疫苗不能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。雖然安全性高，但能產(chǎn)生的保護(hù)的時(shí)間非常短，多年來實(shí)踐表明PRRS滅活疫苗效果不理想。PRRS活疫苗一般都是將強(qiáng)毒的PRRSV親本毒株多次傳代致弱后獲得，親本毒株的毒力越強(qiáng)，傳代后制備的弱毒活活疫苗的免疫原性越好。弱毒活疫苗免疫劑量小，免疫效果較滅活疫苗好[21]，保護(hù)時(shí)間長(zhǎng)，但活疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，懷孕后期的母豬免疫后可能會(huì)流產(chǎn)。

無論是PRRS滅活疫苗還是弱毒活疫苗都不適合做疾病暴發(fā)后的緊急接種免疫，只能免疫健康豬，做PRRS的預(yù)防，體弱豬接種活疫苗也有可能會(huì)發(fā)病。制備滅活疫苗采用的毒株有2種，即NVDC-JXA1株和CH-1a株，經(jīng)典弱毒活疫苗的毒株有3種，分別是由CH-1a強(qiáng)毒致弱獲得的Ch-1R株，2007年獲得新獸藥證書，由勃林格研制的VR2332株，2005年進(jìn)入中國市場(chǎng)，是國內(nèi)第1個(gè)正式批準(zhǔn)上市的PRRS疫苗，由南京農(nóng)大和瑞普生物聯(lián)合研制的R98株，該毒株是由自行分離的PRRS強(qiáng)毒株，連續(xù)細(xì)胞傳代80代致弱后獲得，該毒株與VR2332株的同源性在99.5%以上。高致病性PRRS疫苗的毒株有4種，2011年獲批的有3個(gè)，中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心等研制的JXA1-R株、哈爾濱獸醫(yī)研究所等研制的HuN4-F112株、北京健翔和牧生物等研制的TJM-F92株，2015年由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的GDr180株獲批。豬場(chǎng)選用活疫苗時(shí)，盡量選取與本場(chǎng)流行的毒株同源性高的毒株進(jìn)行預(yù)防，禁止頻繁換用不同活疫苗毒株，不同毒種混用會(huì)導(dǎo)致毒力返強(qiáng)的可能性增大。疫苗使用后減輕豬的臨床癥狀，縮短病毒血癥時(shí)間，降低排毒，提高豬只感染病毒所需的劑量，但不能阻止感染的發(fā)生。豬場(chǎng)可存在多種不同基因譜系的病毒，豬場(chǎng)流行毒株譜系的多樣化，給PRRS防控增加了難度，疫苗只對(duì)同基因譜系病毒產(chǎn)生保護(hù)，不同譜系病毒間交叉保護(hù)力弱。PRRS活疫苗主要適用于感染壓力大的豬場(chǎng)，陰性豬場(chǎng)和妊娠后期的母豬一般不建議使用，由于傳統(tǒng)疫苗的種種缺陷，因此，人們對(duì)安全性高、效力好，適合各種豬只免疫的新型疫苗有很強(qiáng)烈的需求。

4 豬繁殖與呼吸綜合征病毒樣顆粒疫苗

VLPs疫苗在其他某些疾病的防控中已經(jīng)被開發(fā)成商品化疫苗，臨床應(yīng)用效果良好?？蒲泄ぷ髡咭苍赑RRS VLPs疫苗的研制上進(jìn)行了一些探索，并取得了一定的成績(jī)。當(dāng)前研究顯示PRRS VLPs的形成需要2種以上的蛋白的參與。用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的含PRRSV GP5蛋白和M蛋白的VLPs，VLPs大小約50 nm，免疫活性與天然蛋白無任何差別，不同劑量的VLPs免疫小鼠后，效果不同，但均有一定免疫活性[22]。也有研究表明GP2b在促進(jìn)VLPs的釋放中起重要作用。PRRSV的免疫原性基因也可以與其他不同病原的免疫原性基因嵌合成VLPs，能同時(shí)防控多種病原。Wang、Xue等制備了嵌合豬流感病毒(SIV)和PRRSV 主要免疫原性蛋白的VLPs，動(dòng)物免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該嵌合VLPs將是一種潛在的針對(duì)PRRSV和SIV的安全、有效的候選疫苗，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。呂鳳林等制備了由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)和PRRSV主要免疫原性蛋白構(gòu)成的VLPs，并經(jīng)肌注、飲水、滴鼻等不同途徑免疫豬，檢測(cè)其免疫效果，結(jié)果顯示，該VLPs可同時(shí)刺激豬只產(chǎn)生針對(duì)3種病原的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，且對(duì)各階段豬安全性好，具有良好的應(yīng)用前景，可實(shí)現(xiàn)一苗防多病，為新型疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。采用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了乙型肝炎病毒核心蛋白與PRRSV GP5融合蛋白，可自主裝配形成VLPs，體外試驗(yàn)表明，該VLPs能抑制PRRSV對(duì)細(xì)胞的感染，VLPs濃度越高抑制效果越好[23-24]。用一種新型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了含PRRSV GP5-GP4-GP3-GP2a-M蛋白的VLPs，用PLGA納米粒包埋后，滴鼻免疫豬后進(jìn)行攻毒，檢測(cè)免疫效果，結(jié)果顯示，免疫接種后，豬體能同時(shí)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，且能明顯減少豬肺中的病毒載量[25]。PRRS VLPs疫苗研究剛剛起步，至于PRRSV哪種蛋白更能促進(jìn)VLPs的形成，并保持良好的免疫原性，以及哪種佐劑能提高免疫效果都需要進(jìn)一步探索。

5 小結(jié)與展望

PRRS是當(dāng)前對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一，可損害豬免疫器官，造成豬只免疫抑制，對(duì)其他疾病的易感性增加。當(dāng)前所用滅活疫苗保護(hù)力有限，活疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)是野毒感染還是疫苗免疫抗體不能鑒別。PRRSV存在抗體依賴的感染增強(qiáng)作用(ADE)現(xiàn)象；且極易發(fā)生變異，不同類型毒株沒有很好的交叉保護(hù)，給傳統(tǒng)疫苗的研制造成了困難，迫切需要研制一種新型疫苗防控該病。VLPs疫苗是當(dāng)前新型疫苗研究的熱點(diǎn)，安全性好，能誘導(dǎo)機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生兩種不同的免疫應(yīng)答反應(yīng)，即體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，科研工作者研制了一些VLPs疫苗，并實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，免疫效果也得到了廣泛的認(rèn)可，但由于種種原因，真正商業(yè)化的VLPs疫苗產(chǎn)品很少。PRRS VLPs疫苗研究取得了一些成績(jī)，但要想真正的產(chǎn)業(yè)化還有大量的工作要做，如基因序列的選擇與優(yōu)化，表達(dá)系統(tǒng)的選擇，表達(dá)量的提高，VLPs的大規(guī)模純化，成本的降低，佐劑的選擇和添加比例，如何評(píng)估疫苗效力等。相信隨著研究的不斷深入，不久的將來，PRRS VLPs疫苗研發(fā)必將取得突破性進(jìn)展，從而為PRRS的防控提供有利的工具。