耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌耐藥現(xiàn)狀及整合子耐藥基因分析*

袁 利　徐羽中*　程明剛　劉香萍　李小永

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是院內(nèi)獲得性感染最為常見的一種條件致病菌，全球廣泛流行，且感染率和耐藥率呈逐步上升趨勢，給臨床抗感染治療帶來挑戰(zhàn)[1-2]。PA可引起醫(yī)院獲得性肺炎、菌血癥、尿路感染、傷口感染、繼發(fā)性腦膜炎，亦可引起腹膜炎、心內(nèi)膜炎及結(jié)膜炎等[3]。碳青霉烯類抗菌素是一類非典型的β-內(nèi)酰胺類藥物，因其抗菌譜廣、對各種革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陰性桿菌和多數(shù)厭氧菌都具有強大的抗菌活性，且與頭孢菌素類藥物不存在交叉耐藥性，對頭孢菌素耐藥的細菌仍有活性而成為臨床上治療PA感染最常用的抗菌素之一。但近年來，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用或濫用，導致耐碳青霉烯類PA菌大量產(chǎn)生，給臨床抗感染治療帶來了新的挑戰(zhàn)[4]。為此，本研究對深圳寶安區(qū)93株耐碳青霉烯類PA耐藥現(xiàn)狀及整合子耐藥基因進行研究。

1　資料與方法

1.1　菌株來源

收集2015年10月至2017年5月深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院臨床分離的耐碳青霉烯類PA93株，其中痰液30株，血液27株，尿液13株，胸腔積液15株，分泌物8株，同一患者不同時期的標本僅納入第1次采集的標本。

1.2　儀器與試劑

采用VITEK-2型全自動細菌生化鑒定和藥敏分析儀和Vitek 2 compact系統(tǒng)(法國梅里埃公司)；StepOne實時聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分析儀(美國AB公司)。DNA marker、PCR擴增試劑盒(大連寶生物有限公司)；DNA Marker DL2000引物(上海Invitrogen公司合成)；16種抗菌藥物均為英國OXOID公司產(chǎn)品；MH瓊脂平板(廣州市迪景微生物科技有限公司)；PowerPac Basic電泳儀和Laboratovies 6000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio－Rad公司)。

1.3　試驗方法

1.3.1藥敏試驗

采用K-B法測定耐碳青霉烯類PA對16種抗菌藥物的敏感性，以大腸埃希菌(ATCC25922)和PA(ATCC27853)作為藥敏質(zhì)控菌，結(jié)果判斷參照美國臨床和實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2011版標準進行。

1.3.2改良Hodge試驗

采用直接菌落懸液法制備大腸埃希菌ATCC25922 0.5麥氏濁度菌懸液，用8.5 g/L氯化鈉溶液按1∶10比例進行稀釋，然后涂在MH瓊脂平板上，干燥3～10 min后在中央貼美洛培南紙片。用無菌拭子挑3個待測菌菌落或者質(zhì)控菌懸液，從紙片邊緣到平板邊緣劃直線的方式接種，37 ℃培養(yǎng)20 h。與大腸埃希菌抑菌環(huán)交接產(chǎn)生向抑菌圈內(nèi)增強生長現(xiàn)象為產(chǎn)碳青霉烯酶陽性菌株。

1.3.3超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測

將待測菌制成0.5麥氏濁度，均勻涂在MH平板上，干燥3～10 min，貼頭孢他啶和(或)克拉維酸、頭孢他啶、頭孢噻肟和(或)克拉維酸等藥敏片，于37 ℃孵育18 h。任一復(fù)合紙片抑菌環(huán)直徑與單一紙片抑菌環(huán)直徑相比≥5 mm，則為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。

1.3.4整合子耐藥基因檢測

(1)細菌DNA提取。挑取單個菌落于1.5 ml生理鹽水中，35 ℃孵育過夜，12000 rpm，離心5 min后去上清液，使用細菌DNA提取試劑盒進行基因組DNA小量純化，操作嚴格按試劑盒說明書進行。PCR反應(yīng)體系為50 μl，其中Premix Taq 25 μl，DNA模板3 μl，20 μmol/L的引物2 μl，滅菌蒸餾水20 μl。

(2)擴增條件。94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→55 ℃30 s→72 ℃1 min→30個循環(huán)后→72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠，在5 V/cm環(huán)境下電泳30 min，后用Laboratovies 6000凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.4　統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　藥敏結(jié)果

在93株耐碳青霉烯類PA中，對16種抗菌素藥物耐藥率＜60%以上的占43.75%，其中最高的為復(fù)方新諾明和氨芐西林和(或)舒巴坦，耐藥率分別為97.0%和95.0%，其次為替卡西林和甲氧芐啶和(或)磺胺甲惡唑，耐藥率分別為85.0%和82.0%，耐藥率最低的為多粘菌素E，為11.0%，其次為亞胺培南和美洛培南，耐藥率分別為20.0%和23.0%，見表1。

表1　93株P(guān)A對16種抗菌素的耐藥率(%)

2.2　PA碳青霉烯酶及β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果

改良Hodge法檢測93株P(guān)A中的碳青霉烯酶陽性菌株75株，陽性率為80.7%，β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株53株，陽性率為57.0%。改良Hodge法與PCR比較，檢測碳青霉烯酶存在假陽性和假陰性，但差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2　改良Hodgo法與PCR檢測碳青霉烯酶結(jié)果比較[株]

2.3　PA整合子耐藥基因檢測結(jié)果

在93株P(guān)A整合子耐藥基因檢測中，陽性率最高的為blaSHV-11基因(占81.7%)，其次為blaKPC-2基因(占63.4%)；基因陽性率最低的為blaSHV-142和blaIMP-4基因，分別為2.2%和4.3%；3株同時檢出blaKPC-2和blaTEM-1基因，1株同時檢出blaCTM-M-14基因和blaCTM-M-65基因，78株同時檢出3種及以上耐藥基因，見表3，如圖1所示。

表3　93株P(guān)A整合子耐藥基因陽性率

圖1　部分耐藥基因凝膠電泳圖

3　討論

PA是院內(nèi)獲得性感染最為常見的一種條件致病菌，屬非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，常導致皮膚軟組織、呼吸道、泌尿道、生殖道及院內(nèi)等感染，呈全球性流行。有關(guān)研究結(jié)果顯示，PA感染率為10.3%，僅次于大腸埃希菌，居第2位[5]。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌素的廣泛應(yīng)用及侵入性診療手段的普及，PA感染率及耐藥率呈逐年上升趨勢，已成為院內(nèi)感染主要病原菌，甚至對碳青霉烯類抗菌素產(chǎn)生了多重性耐藥，給臨床抗感染治療和控制院內(nèi)感染帶來了極大的挑戰(zhàn)[6-7]。因此，不同地區(qū)對耐碳青霉烯類PA的耐藥性和整合子耐藥基因進行研究，分析其耐藥機制，對指導臨床科學用藥和控制院內(nèi)感染具有重大的臨床意義[8-9]。

碳青霉烯類抗菌素是由改變青霉素結(jié)構(gòu)而研發(fā)的一類β-內(nèi)酰胺類藥，殺菌機理主要通過抑制細菌細胞壁合成粘肽酶，即青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)的合成，進而阻止細胞壁粘肽的合成導致細菌細胞壁缺損、通透性增加、菌體膨脹、胞漿滲透壓改變和細菌溶解等途徑殺滅細菌。同時，碳青霉烯類抗菌素殺菌作用具有選擇性，對宿主細胞毒性小而廣泛應(yīng)用于臨床抗感染治療。

碳青霉烯類抗菌素因抗菌譜廣和抗菌活性強、殺菌效率快、能減少細菌內(nèi)毒素的釋放、對β-內(nèi)酰胺酶[如頭孢菌素酶(cephalosporin enzyme，AmpC)具有高度的穩(wěn)定性、對腸桿菌科細菌具有高度的敏感性、療效肯定及能血液透析清除[10-11]等優(yōu)點而廣泛用于臨床抗感染治療，是治療PA感染首選藥物。但近年來，隨著碳青霉烯類抗菌素廣泛使用和濫用，耐藥菌逐漸出現(xiàn)并可見多重耐藥菌株，對第3代、4代頭孢和亞胺培南在內(nèi)的多種β內(nèi)酰胺類及氨基糖苷類抗菌素產(chǎn)生了耐藥，且呈逐年上升的趨勢[9-12]。本研究結(jié)果顯示，深圳寶安地區(qū)93株耐碳青霉烯類PA對16種抗菌素耐藥率與國內(nèi)外有關(guān)文獻報導相一致，表明本地區(qū)PA對碳青霉烯類抗菌素耐藥情況非常嚴重，應(yīng)引起當?shù)蒯t(yī)療機構(gòu)高度重視。

β-內(nèi)酰胺酶陽性可引起PA對青霉素類、頭孢菌素類等β-內(nèi)酰胺酶類藥耐藥，而碳青霉烯酶陽性可引起PA對碳青霉烯類藥耐藥。本研究結(jié)果顯示，深圳寶安地區(qū)93株P(guān)A碳青霉烯酶陽性率達到80.7%，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶陽性率為57.0%，表明了碳青霉烯酶陽性和(或)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶陽性是導致本地區(qū)PA對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥的主要原因之一。

整合子是PA對碳青霉烯類抗菌素產(chǎn)生耐藥的一個新的耐藥基因傳播元件，由5保守區(qū)、3保守區(qū)及兩者之間的可變區(qū)構(gòu)成，整合子對PA的耐藥和多重耐藥的形成起著重要作用[16-18]。其中，blaSHV基因是編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因，可引起PA對青霉素類、頭孢菌素類等β-內(nèi)酰胺酶類藥耐藥；blaVIM和blaIMP基因是編碼碳青霉烯酶的基因，可引起PA對碳青霉烯類藥耐藥；aadA是編碼氨基糖腺苷轉(zhuǎn)移酶的基因及aadB是編碼氨基糖苷類乙?；D(zhuǎn)移酶的基因，可引起PA對慶大霉素、妥布霉素的耐藥。本研究結(jié)果顯示，深圳寶安區(qū)93株P(guān)A整合子耐藥基因陽性率最高的為blaSHV-11和blaKPC-2基因，陽性率最低的為blaSHV-142和blaIMP-4基因；3株同時檢出blaKPC-2和blaTEM-1基因，1株同時檢出blaCTM-M-14和blaCTM-M-65基因，78株同時檢出3種及以上耐藥基因，表明了PA產(chǎn)生整合子耐藥基因也是本地區(qū)PA對碳青霉烯類抗菌素產(chǎn)生耐藥的重要原因之一。

深圳寶安地區(qū)PA對碳青霉烯類抗菌素耐藥情況比較嚴重，耐藥機制復(fù)雜，同一地區(qū)流行的耐藥菌株具有相似的基因型及耐藥基因。因此，不同地區(qū)應(yīng)進行耐碳青霉烯類PA耐藥情況和耐藥基因檢測，根據(jù)藥敏結(jié)果以及感染部位的血藥濃度等合適選擇抗菌素規(guī)范化使用，減少耐藥菌株的產(chǎn)生[19]。

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