水貂阿留申病毒檢測方法研究進展

劉 藝，冷 雪，時 坤，李健明，曾范利，宗 穎，宮慶龍，張姍姍，孫志博，劉亞東，杜 銳

（吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春130118）

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,ADM)是一種能夠令宿主終生攜帶并引起機體免疫系統(tǒng)紊亂的毒血癥。水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus，ADV)感染幼貂，可在其肺泡Ⅱ型細胞高效復制，引起急性致死性間質(zhì)性肺炎，而感染成年貂，則主要感染淋巴結巨噬細胞，呈低水平病毒復制，引起以脾腫大、高丙種球蛋白血癥、漿細胞增多、動脈炎、免疫復合物型腎小球腎炎為特征的慢性疾病，可致使水貂消瘦，繁殖力低下[1-2]。病畜的臨床表現(xiàn)分急性和慢性。急性患病個體通常無明顯癥狀突然病死，死前出現(xiàn)痙攣。慢性病例一般有2個～3個月的潛伏期，發(fā)病后的病程可持續(xù)數(shù)月甚至1年，病死率極高?；疾游镆话惚憩F(xiàn)為極度口渴、暴飲，并產(chǎn)生一定程度的神經(jīng)癥狀，主要表現(xiàn)為抽搐痙攣、共濟失調(diào)、后驅(qū)麻痹等?；疾游锸秤麥p退甚至拒食，被毛無光、稀疏、粗糙、絨毛驟減。我國所有的水貂養(yǎng)殖場幾乎均被感染，嚴重者感染率高達94.59%[3]。截止到目前為止，仍沒有成品疫苗能夠用于有效的預防和治療該病，因此，亟需可大批量檢測、操作簡單、快速且特異性強的檢測方法來幫助凈化該病。

1 碘凝集試驗

碘凝集試驗(iodine agglutination test,IAT)的原理是攜帶ADV的水貂，其血清在魯戈氏碘液的凝集試驗下白蛋白和球蛋白比例發(fā)生變化,生成大塊的褐色絮狀凝集物。此方法的特點操作簡單、快速，比較經(jīng)濟，適于群檢。但由于如結核病、肝病、腎病、肺病等可引起血清γ球蛋白增高的疾病，都能出現(xiàn)ITA的陽性反應，且在ADV感染1周以內(nèi)的檢測可能出現(xiàn)IAT陰性反應，所以使用該方法的檢測結果中容易出現(xiàn)假陰性、假陽性，因而，這種做法只能作為檢測該病的一種輔助方法。

戚永娜等[4]對30 個45 日齡水貂血清樣本分別進行了IAT與對流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis CIEP)檢測，結果顯示兩者的符合率為63.33%。任二軍等[5]檢測的成年水貂ITA與CIEP對的符合率達到了81.55%。二者檢測結果差距懸殊的原因可能是由檢測水貂的日齡差距所引起。前者所檢測的45日齡水貂體內(nèi)γ球蛋白含量較低，用ITA得不到有效的檢測。

2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術的應用已在國內(nèi)國外日漸成熟，因其自動化的檢測方式，節(jié)省了大量人力，非常適合批量檢測。Ma F等[6]通過合成了VP2蛋白的六種肽，將其用作ELISA抗原以檢測ADV抗體，篩選出反應原性好的肽開發(fā)了ELISA方法，其敏感性為98.0%、特異性為97.5%。此外，通過ELISA檢測到的342例早期感染樣本在CIEP檢測中顯示為陰性，在PCR檢測中顯示為陽性，其中43.6%(149/342)為真陽性。這些結果表明，與CIEP相比，肽ELISA具有更好的靈敏度，因此在檢測抗AMDV抗體的血清學篩選中選用肽ELISA效果更好。Chen X等[7]利用重組VP2332-452蛋白作為抗原建立ELISA檢測法，同時利用CIEP作為參考試驗與Western bolt檢測結果相比較。結果顯示，VP2332-452ELISA方法的特異性和靈敏度分別為97.9%和97.3%，高于Western bolt檢測方法。因此，該VP2332-452ELISA可作為針對ADV抗體檢測的優(yōu)選方法。

3 對流免疫電泳

CIEP是國際上公認的ADV檢測金標準，廣泛應用于各國水貂養(yǎng)殖廠ADV檢測。該方法操作簡單，可檢測到感染初期水貂的ADV抗體，在這方面優(yōu)于IAT。與此同時，該方法特異性高達97%，敏感性超過75%，證明了該方法出現(xiàn)假陽性的概率較低[8]。由于該方法抗原制備復雜且昂貴，國內(nèi)外學者始終致力于對其抗原的制備與優(yōu)化。關于抗原的制備方法，目前主要是從臟器與細胞中提取，采用真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)表達的蛋白也可作為抗原[9]。

4 聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)方法針對病毒檢測的特異性，準確性均遠超CIEP方法，但因其檢測成本較高等因素的限制，用于ADV感染情況檢測的樣本小，檢測的結果不能夠準確地反映一個地區(qū)養(yǎng)殖水貂 ADV感染的實際情況。

許秋等[10]根據(jù)基因庫中ADV 的NS1 基因核苷酸序列，設計合成了一對特異性引物，優(yōu)化各反應條件，建立了ADV的PCR檢測方法，與對CIEP相對比，PCR法檢測ADV的陽性檢出率提高了7%，達到了90%。表明PCR技術檢測的特異性和靈敏性相比CIEP 均有所提高，可更加快速、準確地檢測ADV。2013年，張蕾等[11]利用 PCR方法首次發(fā)現(xiàn)了國內(nèi)貉感染ADV。邵西群等[12]曾報道 PCR 檢測方法靈敏性高，可直接應用于檢測ADV。利用 PCR檢測方法發(fā)現(xiàn)來自不同時期的血樣、不同組織樣品的檢測結果存在差異，這表明了動物感染過程中病毒的不穩(wěn)定性。

5 納米PCR方法

納米PCR方法(nanoparticle-assisted polymerase chain reaction,NanoPCR)作為一種新進發(fā)現(xiàn)且尚未開發(fā)完整的PCR技術，其技術原理尚不明確，目前廣泛推測其利用膠體金所具備的良好的導熱性與吸附DNA的能力，使反應快速達到目標溫度，增強了反應靈敏度并且減少了反應的非特異性。

楊瑞梅等[13]利用ADV NS1基因保守序列設計了一對特異性引物，并優(yōu)化納米 PCR反應條件及膠體金濃度，建立了ADV納米 PCR檢測方法，該方法中膠體金制備簡單，用量少，不僅使檢測成本降低，也使PCR反應體系擴增效率提高了10倍，有利于ADV的大量檢測。對比質(zhì)粒模板與糞尿樣品提取到的DNA模板的納米PCR檢測結果，前者是后者的10倍?？紤]到在血清學檢測中因采血對水貂造成的應激反應帶來的危害，而若能從糞便、尿樣中檢測該病毒，將會給該病的診斷提供極大便利，為ADV檢測提供新的方法。

6 實時熒光定量PCR方法

實時熒光定量PCR( real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法有其獨特的優(yōu)點，包括特異、快速、敏感性高、熒光動態(tài)檢測、結果自動分析等，當前已被廣泛應用于各類病毒性疫病的診斷研究。新型的TaqMan-MGB探針技術，其特點是探針本身不發(fā)熒光，3′端連接有MGB基團，該基團的存在能增加探針的解鏈溫度，因此實時熒光定量PCR方法可以設計比較短的探針，提高了探針特異性，解決了普通TaqMan探針需要設計較長探針的局限性[14]。不僅熒光本底更低、分辨率與敏感度更高、穩(wěn)定性及特異性更強，結果更為精確，而且可將探針的Tm值提高10℃左右[15-16]。MGB技術的優(yōu)勢可在雙重或多重熒光定量PCR方法中得到更好的體現(xiàn)。

賈赟等[17]利用TaqMan-MGB探針中MGB基團所具有的增加解鏈溫度、減短探針長度的特點，建立了水貂阿留申病病毒MGB熒光定量PCR檢測方法。該法探針較短，很大程度上增加了檢測的特異性，解決了普通的TaqMan因探針設計較長所造成的特異性不強的弊端[18]。

7 免疫復合物檢測法

免疫復合物檢測法(circulating immune complex,CIC)由于水貂感染ADV后體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體量很少，甚至不產(chǎn)生中和抗體，而產(chǎn)生的大多數(shù)抗體，不僅不能中和病毒，還能介導抗體依賴性增強作用，從而促進ADV進一步侵染靶細胞，并與機體產(chǎn)生的抗體形成復合物，因此，針對抗原抗體復合物的檢測也成為了診斷該病的一種方法。趙元楷等[19]所建立的聚乙二醇沉淀比濁法就是通過檢測抗原抗體復合物，進而檢測ADV，該方法已在臨床實踐中應用。

8 膠體金試紙條

膠體金試紙條(colloidal gold test strip,GICA)是一種將免疫膠體金技術與層析法(以膜為固相載體的快速檢測技術)相結合的檢測技術，在動物疫病診斷領域發(fā)展迅速。利用膠體金免疫層析技術檢測ADV不僅具有較強的特異性，而且檢測迅速、不需要特殊的儀器設備，并具有操作流程簡潔、檢測結果明顯、易于判斷、特異性強、敏感性髙等優(yōu)點，適用于大規(guī)模檢測以及試驗條件較低場所的臨床樣品檢測。目前，對于檢測ADV抗原抗體的GICA研究并不多。徐磊[20]初步建立了GICA法，其利用重組VP2蛋白作為標記抗原來診斷ADM,該診斷方法相較于普通診斷方式更加快速，且定性準確、反應靈敏。

9 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification ，LAMP)是一種恒溫擴增技術，使用該檢測技術對 ADM進行臨床診斷和流行病學調(diào)查時具有簡單、快速、敏感和準確的特點，既能滿足ADV的實驗室檢測，又適合于基層的快速篩查[21]。賈赟等[22]建立了ADV LAMP檢測方法，并用LAMP、定量PCR、普通PCR方法對實驗室保存的水貂病料進行ADV檢測，LAMP與定量PCR檢測結果的符合率為100%，與普通PCR相比，陽性病料檢測檢測符合率為91.8%，陰性病料檢測結果符合率為92.9%，說明可以用于臨床樣品的大批量檢測。

10 防控

Liu D等[23]利用分離得到的ADV大連125株構建了全基因核酸疫苗。使用pcDNA3.1-ADV-428-487核酸疫苗免疫水貂，獲得ADV抗體。ADV攻毒后對比發(fā)現(xiàn)，使用pcDNA3.1-ADV-428-487核酸疫苗免疫的水貂血清中γ-球蛋白含量較低，盡管pcDNA3.1-ADV-428-487核酸疫苗尚未表現(xiàn)出對ADV的完全保護，但它在防控由ADV引起的水貂種群損失方面，具有作為疫苗潛在的優(yōu)勢。

11 小結

由于我國養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度大，養(yǎng)殖方式較為原始，養(yǎng)殖區(qū)沒有統(tǒng)一規(guī)劃，養(yǎng)殖戶缺乏對養(yǎng)殖場疫病的防控意識。且甚少的進行環(huán)境檢測以確認病毒的傳播途徑[24]。這些都增加了ADM在我國的防控和根除的難度。CIEP是目前為止國際上公認的檢測ADV抗體的一般方法[25]。ELISA適合可實現(xiàn)高通量檢測，已經(jīng)被加拿大和美國承認該檢測方法在臨床實踐中可提供參考，目前大多數(shù)國家開發(fā)的控制該病是基于CIEP或ELISA的血清學測試[26-27]。膠體金試紙條能夠?qū)崿F(xiàn)ADV快速檢測，PCR法可以彌補CIEP的漏診，因此在檢測時需要根據(jù)實際情況，如樣本量、檢測人員的操作能力等選擇合適的檢測方法，從而達到逐步淘汰陽性水貂，凈化種群的目的。