大豆蛋白澄清劑對(duì)‘赤霞珠’干紅葡萄酒品質(zhì)的影響

魯榕榕，馬騰臻，張波，Antonio Morata，祝霞，韓舜愈*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州，730070)2(馬德里理工大學(xué) 高等農(nóng)業(yè)工程技術(shù)學(xué)院化學(xué)與食品技術(shù)系，西班牙 馬德里)

澄澈外觀、良好色澤及協(xié)調(diào)香氣是優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒重要的感官品質(zhì)。新釀制的葡萄酒中含有多酚、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，酒體渾濁或極不穩(wěn)定，下膠澄清是指通過加入能夠迅速沉降這些懸浮物的物質(zhì)，使酒體在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較好澄清度及穩(wěn)定性的工藝操作[1-2]。常用的下膠材料主要分為天然凝膠、蛋白類下膠劑(包括動(dòng)物和植物蛋白)和化學(xué)合成下膠劑三類[2]。皂土是最常用的天然凝膠下膠澄清劑，其澄清效果較好，但會(huì)與紅葡萄酒中色素及香氣物質(zhì)結(jié)合，從而嚴(yán)重影響酒體色澤及風(fēng)味品質(zhì)，且使用前需提前用溫水浸泡，處理后會(huì)使酒體產(chǎn)生大量酒腳，不便于生產(chǎn)操作[3]；化學(xué)合成的下膠澄清劑PVPP和酪蛋白酸鉀等易溶解、使用方便，且PVPP可除去紅葡萄酒中的劣質(zhì)單寧，改善其感官品質(zhì)，但也會(huì)對(duì)紅葡萄酒的色澤有較大影響[4]；酪蛋白和明膠作為常用的動(dòng)物蛋白類下膠澄清劑，能夠與紅葡萄酒中的單寧結(jié)合，降低酒體收斂性，提高柔和度，且對(duì)品質(zhì)影響較小，但其可能會(huì)引起一些特殊人群的過敏反應(yīng)，存在一定的安全隱患[4]。

植物蛋白類下膠澄清劑能夠在很大程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)澄清劑的這些缺陷，研究表明其在保證下膠質(zhì)量的同時(shí)，對(duì)葡萄酒色澤及香氣品質(zhì)影響較小，具有較高安全性，還可用于嚴(yán)格素食主義者葡萄酒的生產(chǎn)[3, 5-6]。目前，已有部分學(xué)者對(duì)谷朊蛋白在葡萄酒中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，如GONZáLEZ[7]研究了皂土、明膠、卵清蛋白和谷朊蛋白對(duì)新釀制和陳釀的紅葡萄酒色澤及色素成分的影響，表明谷朊蛋白在新酒中的澄清效果優(yōu)于動(dòng)物蛋白，且其對(duì)酒樣色澤品質(zhì)影響較?。磺埒漑8]等關(guān)于‘蛇龍珠’干紅葡萄酒的研究表明，谷朊蛋白具有較好的澄清效應(yīng)，但過量添加會(huì)導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)下降；然而HISCHENHUBER[9]研究發(fā)現(xiàn)谷朊蛋白可能會(huì)引起食物過敏和腹腔疾病等不良反應(yīng)。

植物蛋白來源廣泛、種類繁多，具有較大應(yīng)用潛力，但目前報(bào)道的可用于葡萄酒下膠澄清的植物蛋白還較少，有待進(jìn)一步開發(fā)。GRANATO等[5]研究了豆類蛋白(大豆蛋白、豌豆蛋白、扁豆蛋白)和谷朊蛋白4種植物蛋白澄清劑對(duì)白葡萄酒澄清效果的影響，結(jié)果表明大豆蛋白澄清效果不亞于谷朊蛋白，且對(duì)原花色素含量的影響較小，可用于白葡萄酒的澄清處理，但有關(guān)其在紅葡萄酒中的應(yīng)用以及對(duì)酒體色澤和香氣品質(zhì)影響的研究較少。

同國(guó)外優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒相比，我國(guó)西部產(chǎn)區(qū)存在醇香不足、色度較淺、色澤老化快等問題，這也是多年來一直制約當(dāng)?shù)馗杉t葡萄酒品質(zhì)提升的關(guān)鍵問題之一。因此，如何通過下膠澄清劑或澄清工藝的改良，減少生產(chǎn)過程中色素及香氣成分的損失在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要意義。本試驗(yàn)以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)自產(chǎn)的‘赤霞珠’干紅葡萄酒作為試材，比較皂土、明膠、酪蛋白、大豆蛋白和聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)5種不同類型澄清劑的澄清效果及其對(duì)酒樣基本指標(biāo)、顏色、酚類物質(zhì)及揮發(fā)性香氣的影響，以期為紅葡萄酒品質(zhì)的調(diào)控與新型下膠澄清劑的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

‘赤霞珠’葡萄于2015年采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄種植基地，含糖量約為20.3～21.0 °Brix，并于2016年進(jìn)行釀制。

釀酒酵母[紅佳釀 Vintage Red(VR)]，意大利Enartis公司；大豆蛋白、皂土、酒酒球菌(OMEGA)、果膠酶(Cuvee Blanc)，法國(guó)Lallemand公司；酪蛋白、福林酚、2-辛醇(色譜純)，美國(guó)Sigma公司；明膠、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、磷鉬鎢酸顯色劑及無水葡萄糖、一水合沒食子酸等常規(guī)試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；費(fèi)林試劑、次甲基藍(lán)指示劑及酚酞指示劑等均按GB/T 603—2002.《化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備》進(jìn)行配制。

1.2　儀器與設(shè)備

TRACE 1310氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、ISQ型單四級(jí)桿質(zhì)譜儀、Genesis 10S型紫外-可見分光光度儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美國(guó)Agilent Technologies公司；固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅(divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-siloxane，DVB/CAR/PDMS)萃取頭，美國(guó)Surpelco公司；CP 214型電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；DF-II集熱式恒溫磁力攪拌器，金壇市恒豐儀器制造有限公司；160350D型沸點(diǎn)測(cè)定儀，法國(guó)DujardinSalleron公司；BCD-539WF型冰箱，青島海爾股份有限公司；18100摩爾超純水機(jī)，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器制造有限公司。

1.3　方法

1.3.1葡萄酒釀制

篩選適量品質(zhì)較好且成熟度一致的‘赤霞珠’葡萄除梗破碎，添加50 mg/L SO2(以偏重亞硫酸鈉形式)及200 mg/L果膠酶，低溫浸漬48 h后，接種0.2 g/L釀酒酵母并于25～28 ℃下進(jìn)行酒精發(fā)酵，至殘?zhí)堑陀? g/L皮渣分離終止發(fā)酵(發(fā)酵時(shí)間約為12 d)，然后接種0.02 g/L酒酒球菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵(15～18 ℃，約14 d)，蘋果酸低于0.5 g/L即完成發(fā)酵，進(jìn)行兩次倒罐去酒泥后，酒樣在低溫下密封貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2下膠澄清試驗(yàn)

皂土和明膠用適量溫水配制成100 g/L的溶液，浸泡膨脹12 h后，攪拌均勻備用；大豆蛋白、酪蛋白和PVPP則直接配制成100 g/L的溶液，用200 mg/L SO2保存?zhèn)溆肹10]。

將酒樣分裝于250 mL透明玻璃瓶中，加入5種下膠澄清劑母液并調(diào)整其濃度統(tǒng)一分別為100、200、300 mg/L(通過預(yù)試驗(yàn)確定5種下膠澄清劑相同的有效濃度范圍[10-11])，以自然澄清酒樣作為對(duì)照，室溫下避光靜置兩周后，記錄瓶底酒泥厚度并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3基本指標(biāo)測(cè)定

總酸：采用酸堿滴定法[12]，結(jié)果以酒石酸(g/L)計(jì)。

揮發(fā)酸：室溫下，用特制蒸餾裝置蒸餾10 mL酒樣，收集餾出液以后，采用酸堿滴定法進(jìn)行測(cè)定[12]，結(jié)果以乙酸(g/L)計(jì)。

總糖：采用斐林試劑法[12]，結(jié)果以葡萄糖(g/L)計(jì)。

酒精度：采用沸點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定。

透光率：利用紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)酒樣在波長(zhǎng)為680 nm處的透光率，以蒸餾水為對(duì)照[1]。

色度、色調(diào)：參照SIMONATO[13]方法，酒樣用相同pH值的緩沖溶液稀釋5倍后，分別測(cè)定其在波長(zhǎng)為420、520、620 nm處的吸光度值，即A1、A2、A3，三者之和為酒樣色度，前兩者之比為色調(diào)。

單寧：參照NY/T 1600—2008 《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測(cè)定：分光光度法》[14](y=0.118 8x-0.000 7，R2=0.999 1)。

總酚：采用FOLIN-CIOCALTEN比色法[15]測(cè)定。將1 mL酒樣用蒸餾水稀至100 mL后，取1 mL樣品溶液加入蒸餾水5 mL、1 mol/L的FOLIN-CIOCALTEN顯色劑1 mL和7.5%的Na2CO3溶液3 mL進(jìn)行顯色，靜置2 h后，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=0.102 4x-0.005 8，R2=0.999 3)計(jì)算總酚含量。

花色苷：參照CHRIS[16]方法。取適量酒樣于4 ℃，5 000 r/min離心10 min，然后進(jìn)行后續(xù)操作。(1)用緩沖液將酒樣稀釋10倍后，測(cè)其在520 nm處吸光度，記為A520；(2)取100 μL酒樣，加10 mL 1 mol/L的鹽酸溶液，室溫靜置3～4 h后，測(cè)其在520 nm處吸光度，記為A520-H；(3)取2 mL酒樣，加100 μL 6% 的NaHSO3溶液，混勻后立即測(cè)其在520 nm處吸光度，記為A520-S?？偦ㄉ?、單體花色苷、聚合花色苷和顯色花色苷的含量分別按公式(1)、(2)、(3)、(4)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

柔和指數(shù)：參照張佳濤[17]方法，按公式(8)計(jì)算：

S=A-(T+C)

(8)

式中：S，樣品柔和指數(shù)；A，乙醇體積分?jǐn)?shù)，%；T，總酸含量，g/L；C，單寧含量，g/L。

蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍(lán)法[18]測(cè)定。取適量酒樣離心，取1 mL上清液，加5 mL考馬斯亮蘭G250試劑，充分混合放置2 min后，于595 nm處測(cè)量吸光度，記錄并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得酒樣中蛋白含量。

蛋白穩(wěn)定性：參照POCOCK[19]方法，取200 mL經(jīng)0.45 μm膜過濾酒樣于80 ℃恒溫水浴6 h后，4 ℃恒溫冷卻12 h，然后分別測(cè)定540 nm處加熱前與冷卻后的吸光度，若兩者差值≤0.02，則樣品穩(wěn)定。

1.3.4揮發(fā)性香氣成分的測(cè)定

1.3.4.1香氣富集

取8 mL酒樣于15 mL樣品瓶中，加入2 g NaCl和100 μL內(nèi)標(biāo)2-辛醇(濃度為1.664 mg/L)，加轉(zhuǎn)子密封，置于磁力攪拌器上，40 ℃下水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。萃取結(jié)束后，取出萃取頭插入GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行香氣檢測(cè)。

1.3.4.2GC-MS條件

參照陳霞[20]方法，并略作調(diào)整。

色譜條件：色譜柱：DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持7 min，以4 ℃/min升至200 ℃，保持8 min；載氣(He)流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度240 ℃；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量70 eV；傳輸線溫度220 ℃；離子源溫度240 ℃；質(zhì)譜掃描范圍m/z50～350。

1.3.4.3香氣成分分析

定性分析：采用保留指數(shù)(RI)和NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索比對(duì)進(jìn)行定性，譜庫比對(duì)時(shí)要求匹配度大于800。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)為2-辛醇。計(jì)算公式[21]如下：

(9)

式中：X，香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/L；f，內(nèi)標(biāo)物的校正因子，f=1；A，測(cè)得香氣物質(zhì)的峰面積；c，內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，mg/L；A0，測(cè)得內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.4　數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel 2013對(duì)樣本(n=3)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，IBM SPSS Statistics 19.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。其中，采用多因素方差分析(Duncan法)(p<0.05)進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，并對(duì)不同處理酒樣的香氣化合物進(jìn)行主成分分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　澄清劑對(duì)紅葡萄酒澄清效果及基本指標(biāo)的影響

2.1.1澄清效果

圖1表示不同下膠澄清處理后酒樣透光率變化及其酒腳厚度。如圖所示，與對(duì)照相比，下膠澄清后大多數(shù)酒樣的澄清度顯著提高(p<0.05)，且隨澄清劑用量的增加，澄清度呈上升趨勢(shì)(大豆蛋白除外)，但酒腳厚度也逐漸增加。圖1-A中，透光率達(dá)到91%以上的酒樣包括200 mg/L和300 mg/L的PVPP、大豆蛋白和明膠處理組。其中，PVPP 300 mg/L和大豆蛋白200 mg/L 處理酒樣的透光率較高，200 mg/L和300 mg/L明膠處理組次之，且兩者無顯著差異(p>0.05)；但300 mg/L PVPP會(huì)使酒體產(chǎn)生大量酒腳，不利于后續(xù)生產(chǎn)操作。此外，100 mg/L的皂土和酪蛋白幾乎無澄清作用，但當(dāng)用量為200 mg/L時(shí)，酒樣澄清度顯著提高，且300 mg/L皂土處理組澄清度顯著高于200 mg/L，而200 mg/L和300 mg/L的酪蛋白處理酒樣無顯著差異(p>0.05)。

2.2.2澄清劑對(duì)酒樣基本指標(biāo)的影響

由表1可知，與對(duì)照相比，除B1、P3、S1和S2處理組酒精度有所降低(降低0.16%～0.24%)，其他酒樣無顯著變化，說明澄清劑對(duì)酒精度幾乎無影響。經(jīng)下膠澄清處理酒樣的總酸和總糖含量分別降低-0.01～0.12 g/L和0～0.45 g/L，揮發(fā)酸含量上升0～0.06 g/L，但大多數(shù)酒樣與對(duì)照差異不顯著。其中，酪蛋白處理酒樣的總酸含量顯著降低(降低5.62%～6.82%)，而明膠對(duì)總糖有較大影響(降低11.47 %～22.73%)。不同澄清劑對(duì)葡萄酒的柔和度有不同影響，其中B2、B3和L3處理酒樣的柔和指數(shù)顯著提高，而S1處理組則顯著下降(p<0.05)。此外，蛋白類澄清劑(酪蛋白、大豆蛋白和明膠)處理酒樣中，蛋白殘留量與對(duì)照組差異不顯著，未超過葡萄酒中蛋白允許最大量[3]，且酒體蛋白穩(wěn)定性也未受到顯著影響(明膠300 mg/L除外)；而皂土?xí)@著降低酒樣中蛋白質(zhì)含量(p<0.05)，從而提高其穩(wěn)定性(表1)。

表1　各處理酒樣的基本指標(biāo)Table 1　Basic indexes of different fined sample wine

注：處理列中B、C、P、S、G、CK分別表示皂土、酪蛋白、PVPP、大豆蛋白、明膠處理組及對(duì)照組，1、2、3分別表示用量為100、200、300 mg/L；

表中同一指標(biāo)內(nèi)不同字母代表差異顯著，樣本量n=3，p< 0.05；下同。

2.2　澄清劑對(duì)紅葡萄酒色澤及酚類物質(zhì)的影響

如表2，經(jīng)下膠澄清處理酒樣的色度值均低于對(duì)照酒樣，且隨澄清劑濃度的增加呈遞減趨勢(shì)，尤其300 mg/L處理組色度顯著較低(降低12.75%～27.63%)。其中，PVPP、大豆蛋白和明膠處理酒樣的澄清度雖相對(duì)較高，但PVPP和明膠對(duì)酒樣色度影響較大(P3和G3與對(duì)照相比降低27.63%)，而大豆蛋白的影響相對(duì)較小(僅降低5.66%～12.75%)。此外，B3酒樣的色調(diào)值明顯上升，而其他處理組與對(duì)照差異不顯著(C3和P3除外，p>0.05)。

各處理酒樣的顏色變化主要與其多酚化合物變化有關(guān)。與對(duì)照相比，澄清處理酒樣的總酚含量均有所下降，且隨用量的增加而逐漸降低，尤其皂土處理組降低4.76%～13.94%(表2)?；ㄉ帐桥c紅葡萄酒顏色相關(guān)的主要酚類物質(zhì)，下膠澄清后酒樣中總花色苷與單體花色苷含量均有所降低，且隨澄清劑用量的增加呈下降趨勢(shì)(G3除外)。其中，C1和D1處理組的總花色苷僅減少4.38 mg/L和0.91 mg/L，PVPP和明膠處理組的總花色苷則下降較多(降低20.44～46.46 mg/L)，而B1、C1和S1酒樣中單體花色苷含量與對(duì)照相比反而有所上升。處理組聚合花色苷含量顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，其中PVPP和明膠處理酒樣下降16.02%～39.68%。就顯色花色苷含量而言，澄清度較高的處理組(PVPP、大豆蛋白和明膠)低于澄清度較低處理組(皂土和酪蛋白)，其中， PVPP處理酒樣中顯色花色苷下降最多(P2和P3分別降低41.44%和37.31%)，而明膠和大豆蛋白對(duì)其影響相對(duì)較小(降低2.54%～14.47%)。此外，下膠澄清后酒樣中單寧含量也有所降低，尤其皂土處理酒樣中下降4.76%～30.20%，這也是其柔和指數(shù)顯著提高的原因。

表2　各處理酒樣的色度、色調(diào)及酚類物質(zhì)含量Table 2　Color intensity, hue and content of phenolic compound in different fined sample wine

2.3　澄清劑對(duì)紅葡萄酒揮發(fā)性香氣的影響

2.3.1各處理酒樣香氣成分的GC-MS分析

結(jié)合以上分析結(jié)果，試驗(yàn)采用HS-SPME-GC-MS法對(duì)200 mg/L處理酒樣的揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行了檢測(cè)分析。如表3，共檢出85種香氣物質(zhì)，包括24種酯類(約占香氣總量34.25%～38.94%)、29種醇類(45.84%～51.97%)、11種有機(jī)酸類(8.87%～10.84%)、9種萜烯類(2.30%～2.84%)、5種羰基類(0.59%～1.19%)及7種其他化合物(0.68%～1.07%)。不同處理酒樣的香氣物質(zhì)種類及含量有所差異：與對(duì)照相比，處理組中均未檢出乙酸松油酯、乙酸苯乙酯和6-甲基辛烯，但額外檢出鄰甲酚；而皂土處理組香氣總量降低28.83%，大豆蛋白處理組則僅降低10.28%，其他酒樣介于兩者之間，其中PVPP和酪蛋白處理組差異不顯著(p>0.05)。

表3　各處理酒樣中揮發(fā)性香氣化合物的GC-MS分析Table 3　GC-MS analysis of volatile compounds in different fined sample wine

續(xù)表3

序號(hào)香氣化合物RI(DB-WAX)含量/(mg·L-1)對(duì)照對(duì)照大豆蛋白PVPP明膠酪蛋白皂土氣味描述72-己烯酸乙酯12450.43±0.040.36±0.020.35±0.070.39±0.050.36±0.070.45±0.058辛酸乙酯143425.81±0.52a25.47±1.12a23.12±0.06ab20.66±0.21b24.47±0.40a22.81±0.56ab果香、油脂味[23]9壬酸乙酯15301.27±0.081.13±0.061.15±0.15ndndnd哈密瓜、草莓香[24]10乳酸異戊酯15640.59±0.050.42±0.030.53±0.100.51±0.060.46±0.060.55±0.0911癸酸乙酯163817.53±0.19a16.51±1.80ab15.36±0.19bc10.60±1.02d16.51±0.45ab14.62±0.57c脂肪味、果香[24]12辛酸-3-甲基丁酯16570.69±0.030.63±0.070.65±0.100.25±0.090.47±0.030.58±0.0313乙酸松油酯16850.45±0.02ndndndndnd檸檬、薰衣草香[25]149-癸烯酸乙酯16976.12±0.22ab6.55±0.41a5.47±0.39b4.54±0.22c5.89±0.21ab5.90±0.51ab果香[22]15苯乙酸乙酯17450.10±0.02ndndndndnd蜂蜜香[20]16水楊酸甲酯17511.28±0.041.19±0.111.27±0.211.20±0.131.43±0.091.36±0.11冬青葉香[26]17乙酸苯乙酯18132.85±0.022.64±0.022.72±0.382.47±0.182.54±0.102.77±0.17玫瑰、茉莉花香[20]18月桂酸乙酯18414.01±0.03a4.06±0.55a4.02±0.13a3.94±0.21a2.96±0.26b2.91±0.22b甜香、蜂蠟香[22]19花生四烯酸甲酯

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