苯乳酸生產(chǎn)菌的篩選及鑒定

黃國(guó)昌，顧斌濤，黃朝，金丹鳳，熊大維，黃筱萍，劉蘭

(江西省科學(xué)院 微生物研究所，江西 南昌，330096)

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA，又稱(chēng)3-苯基乳酸)是繼乳酸鏈球菌素(Nisin)和ε-聚賴(lài)氨酸(ε-polylysine,ε-PL)之后人們發(fā)現(xiàn)的一種新型生物保鮮劑，相比Nisin和ε-PL，因PLA具有更加寬廣的抑菌譜，不僅能抑制多種食品致病菌，還能抑制引起食品腐敗的真菌，且其溶解性好、對(duì)酸堿和熱穩(wěn)定性強(qiáng)，具有廣泛應(yīng)用于各種食品和果蔬保鮮的潛質(zhì)，因此，近年來(lái)成為了人們研究的熱點(diǎn)。

早在20世紀(jì)90年代，WILKINS等[1]就認(rèn)為蜂蜜中的丁香酸和苯乳酸是主要的抑菌物質(zhì)，但是也有人對(duì)此存在爭(zhēng)議。直到1998年，DIEULEVEUX等[2-3]首次報(bào)道了白地霉(Geotrichumcandidum)發(fā)酵的干酪對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)具有抑制作用，并確定苯乳酸就是主要的抑菌物質(zhì)。隨后，人們?cè)诒饺樗岙a(chǎn)生菌的篩選方面做了許多研究，發(fā)現(xiàn)大部分的乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)都能產(chǎn)生苯乳酸，此外一些丙酸菌(Propionic acid bacteria, PAB)也能生產(chǎn)苯乳酸。LAVERMICOCCA等人[4]報(bào)道Lactobacillusplantarum21B能產(chǎn)生苯乳酸，STROM[5]等從青貯飼料中分離到1株L.plantarumMiLAB393，MAGNUSSON[6]從青草中分離出棒狀乳桿菌(L.coryniformis)，李興峰等[7]從泡菜中分離得到1株植物乳桿菌(L.plantarumSK007)，VALERIO[8]等分離到多種乳酸菌能夠產(chǎn)生苯乳酸。

目前報(bào)道的苯乳酸產(chǎn)生菌的篩選大都采用碳酸鈣溶解圈和抑菌圈的方法進(jìn)行初篩，文中根據(jù)前人報(bào)道的方法進(jìn)行了改進(jìn)，篩選效率更高、目標(biāo)更加明確，從泡菜中分離得到2株苯乳酸高產(chǎn)菌株，并根據(jù)16 S rDNA序列分析，初步對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1樣品

市售各類(lèi)酸菜、泡菜，自制泡菜，酸乳，發(fā)酵面團(tuán)，青貯飼料等。

1.1.2試劑

培養(yǎng)基各組分購(gòu)自上海生工公司，苯乳酸、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自SIGMA公司，甲醇(色譜純)、三氟乙酸(色譜純)購(gòu)自MERCK公司。

1.1.3培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中加入2.0 g/L的苯乳酸；

初篩1下層培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入2.0 g/L苯丙氨酸；

初篩1上層培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入30 g/L的CaCO3(單獨(dú)滅菌)；

初篩2下層培養(yǎng)基：同初篩1下層培養(yǎng)基；

初篩2上層培養(yǎng)基：NB瓊脂培養(yǎng)基；

保藏培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基；

發(fā)酵培養(yǎng)基：改良MRS培養(yǎng)基中加入2.0 g/L苯丙氨酸。

1.1.4指示菌

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均為本研究室保藏。

1.2　方法

1.2.1苯乳酸產(chǎn)生菌篩選方法

取樣品汁液1 mL或樣品梗莖適量接入富集培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌種富集。取0.1 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的菌液接入初篩1下層培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后，注入初篩1上層培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，挑取溶鈣圈大的菌落接種至初篩2下層培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h后，注入初篩2上層培養(yǎng)基，凝固后接入指示菌，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，挑取抑菌圈大的菌落劃線(xiàn)純化。初篩后的菌株分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃兼性厭氧培養(yǎng)48 h后，采用高效液相色譜法(HPLC法)分析發(fā)酵液中苯乳酸的產(chǎn)量，挑選高產(chǎn)菌株進(jìn)行斜面和甘油保存。

1.2.2發(fā)酵液中苯乳酸的檢測(cè)方法

發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心5 min和0.22 μm濾膜過(guò)濾后，采用Waters e2695 Alliance 高效液相色譜分離單元和Waters 2489 UV/Vis檢測(cè)器進(jìn)行分析。參考黃國(guó)昌等[9]方法，色譜柱：Waters Symmetry?C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10.0 μL，流速：1.0 mL/min，流動(dòng)相：A相為體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B相為體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸溶液，洗脫程序：0～20 min為A∶B由10%線(xiàn)性變化為100%，20～23 min為100% A相，23～25 min保持A∶B為10%，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.3菌種初步鑒定方法

純化后的菌株進(jìn)行純培養(yǎng)后，觀(guān)察菌落形態(tài)和顯微觀(guān)察菌體形態(tài)，并提取基因組DNA后，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，找出與其同源性較高的菌株，并初步判定篩選菌株的種屬。

2　結(jié)果與討論

2.1　苯乳酸產(chǎn)生菌的篩選

富集培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)在培養(yǎng)基中添加2.0 g/L的苯乳酸，一方面抑制大部分非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)，另一方面，對(duì)苯乳酸耐受性差的乳酸菌也被淘汰，大大增加了篩選的目標(biāo)性，通過(guò)改進(jìn)的溶鈣圈法對(duì)富集菌進(jìn)行第一次初篩后，50個(gè)樣品中篩選出113株初篩菌。改進(jìn)后溶鈣圈法優(yōu)點(diǎn):富集后的菌液接入含有苯丙氨酸為底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，再在上層注入一層含CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基，一方面可以減少產(chǎn)其他酸菌株的影響，其次，如按其他文獻(xiàn)所述，直接將CaCO3加入培養(yǎng)基中，在凝固時(shí)，CaCO3沉至平皿底部，倒置培養(yǎng)時(shí)，因初篩得到的菌株苯乳酸產(chǎn)量較低，PLA很難與上部的CaCO3接觸而產(chǎn)生溶鈣圈，而本文通過(guò)雙層培養(yǎng)基，恰好使菌落和CaCO3緊密接觸，極大降低了目標(biāo)菌漏篩的可能性，且對(duì)于其他微量產(chǎn)酸菌的篩選提供了借鑒。圖1為改進(jìn)方法和已有文獻(xiàn)報(bào)道方法的比較，可明顯看出，改進(jìn)后的方法出現(xiàn)明顯的溶鈣圈，而在對(duì)照組中只有一個(gè)菌落出現(xiàn)不太顯著的溶鈣圈。通過(guò)第一次初篩后，溶鈣圈情況如表1所示，溶鈣圈直徑大于0.6cm的菌株數(shù)為39個(gè)。挑取溶鈣圈較大的菌落進(jìn)行第二次抑菌圈篩選，如圖2和表2所示，對(duì)兩種指示菌抑菌圈直徑均超過(guò)2.0 cm的菌株共有15株。

圖1　兩種溶鈣圈法的比較Fig.1　Comparison of two methods of dissolving calcium rings

溶鈣圈直徑d/cm菌株數(shù)d≤0.2230.2≤d≦0.4360.4≤d≦0.6230.6≤d≦0.739

圖2　初篩菌株對(duì)指示菌的抑制情況Fig.2　Inhibitory effect of screened strains on indicator bacteria

抑菌圈直徑d/cm菌株數(shù)1≤d≦1.571.5≤d≦2.0172.0≤d≦2.515

15株初篩菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵后，檢測(cè)發(fā)酵液中的苯乳酸含量，結(jié)果如表3所示，得到2株苯乳酸產(chǎn)量大于300 mg/L的復(fù)篩菌株，分別命名為BLPC002和SCPC008，苯乳酸產(chǎn)量分別為358 mg/L和333 mg/L。從篩選的結(jié)果可以看出，本研究通過(guò)改進(jìn)篩選方法后，淘汰了大部分產(chǎn)苯乳酸能力較弱的菌株，經(jīng)改良后的溶鈣圈法和抑菌圈法初篩后，篩選得到的大部分菌株苯乳酸產(chǎn)量都超過(guò)200 mg/L，只有2株苯乳酸產(chǎn)量低于100 mg/L，而目前關(guān)于苯乳酸生產(chǎn)菌篩選的相關(guān)報(bào)道中[7-8,10]，初篩菌搖瓶發(fā)酵苯乳酸產(chǎn)量都在100 mg/L以下，由此可見(jiàn)，改良后的篩選方法能有效提高微量產(chǎn)酸菌的篩選效率。

2.2　菌種的初步鑒定

2.2.1菌株的形態(tài)特征觀(guān)察

培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為白色、凸起、光滑、濕潤(rùn)、易挑取，在顯微鏡下觀(guān)察菌體形態(tài)為桿狀，單獨(dú)、成對(duì)或短鏈排列，如圖3，從菌落形態(tài)和菌體形態(tài)上初步判斷為一種乳桿菌。

表3　初篩菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果Table 3　Results of shaking flask fermentation byscreened strains

圖3　顯微鏡下菌體形態(tài)Fig.3　Microscopic morphology of screened strains

2.2.216S rDNA序列測(cè)定

對(duì)2號(hào)菌和8號(hào)菌純化后，提取基因組DNA，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序并將測(cè)得的16S rDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索，結(jié)果如表4和表5，表明2株菌株均與植物乳酸桿菌16SrDNA序列同源性高達(dá)100%，因此初步判定篩選得到的2株苯乳酸生產(chǎn)菌為植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)。

表4　2號(hào)菌序列比對(duì)結(jié)果Table 4　Results of sequence comparison of strain No.2

3　結(jié)論

(1)對(duì)目前通用的產(chǎn)酸菌篩選方法進(jìn)行了改良，建立了一種準(zhǔn)確、高效篩選微量產(chǎn)酸菌的方法，從自然環(huán)境中篩選得到2株苯乳酸產(chǎn)量大于330 mg/L的苯乳酸產(chǎn)生菌，分別命名為BLPC002和SCPC008；(2)對(duì)2株高產(chǎn)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列鑒定，確定該2株苯乳酸生產(chǎn)菌均為植物乳酸桿菌。

表5　8號(hào)菌序列比對(duì)結(jié)果Table 5　Results of sequence comparison of strain No.8

[1]WILLKINS A,LU Y,TANS.Extractives from New Zealand honeys.4.Linalool derivatives and other components from nodding thistle(Carduusnutans) honey[J].J Agric Food Chem,1993,41(6):873-878.

[2]DIEULEVEUX V,VAN DER PYL D,CHATAUDJ,et al.Purification and characterization of anti-Listeriacompounds produced byGeotrichumcandidum[J].Appl Environ Microbiol,1998,64(2):800-803.

[3]DIEULEVEUX V,GUéGUENM.Antimicrobial effects of D-3-phenyllactic acid onListeriamonocytogenesin TSB-YE medium,milk and cheese[J].J Food Prot,1998,61(10):1 281-1 285.

[4]LAVERMICOCCA P,VALERIO F,EVIDENTEA,et al.Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdoughLactobacillusplantarumstrain 21B[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(9):4 084-4 090.

[5]STROMK S， JOGREN J,BROBERG A,et al.LactobacillusplantarumMiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro) and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllactic acid[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(9):4 322-4 327.

[6]MAGNUSSON J,STROM K,ROOS S,et al.Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria[J].FEMS Microbiol Lett,2003,219(1):129-135.

[7]李興峰, 江波, 潘蓓蕾, 等. 產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌分離篩選及菌種鑒定[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2007, 33(2):1-4.

[8]VALERIO F,LAVERMICOCCA P,PASCALEM,et al.Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J].FEMS Microbiol Lett,2004,233(2):289-295.

[9]黃國(guó)昌,熊大維,黃筱萍,等.高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中苯乳酸和苯丙氨酸含量的研究[J].江西科學(xué), 2016 ,34 (5) :614-618,702.

[10]張莉力,柴虹宇.產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選及鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(5):2 590-2 592.