酶法提取苦苣黃酮的工藝研究

◎ 程麗麗，岳珍珍

（漯河食品職業(yè)學(xué)院食品工程系，河南　漯河　462000）

苦苣是一種草本植物，生長(zhǎng)期為一年或二年，屬于菊科、菊苣屬?？嘬母缓被?、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，其嫩葉已被人們作為蔬菜廣泛食用?？嘬耐瑫r(shí)可作為中藥材使用，有涼血清熱、消炎解毒、保肝利膽、抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫力等功效[1-2]?？嘬闹悬S酮類化合物含量也比較豐富，對(duì)其提取研究目前已經(jīng)出現(xiàn)的有超聲提取法[3-4]、超高壓提取法[5]、乙醇浸提法[6]等。本研究采用纖維素酶和微波相結(jié)合的方法對(duì)苦苣中的總黃酮進(jìn)行提取和工藝優(yōu)化，為合理開(kāi)發(fā)利用苦苣提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料與試劑

苦苣，采摘于漯河食品職業(yè)學(xué)院北校區(qū)，清洗、干燥（55 ℃）、粉碎，過(guò)篩取60目苦苣粉，備用；纖維素酶，購(gòu)自上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；蘆丁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇、硝酸鋁，均為分析純?cè)噭?，?gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

202-00A干燥箱（天津順諾儀器科技有限公司）、DFY-400C粉碎機(jī)（上海谷寧儀器有限公司）、UV1800PC紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]

將純度為98%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品放入干燥箱干燥至恒重，用電子天平精確稱取10.00 mg放入燒杯，加入一定量30%的乙醇溶液充分溶解，移至100 mL容量瓶定容，充分搖勻得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1 mg/mL。依次精確吸取配備好的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4 mL和5 mL分別放入10 mL的容量瓶中，分別加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min，再加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，30%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，510 nm處測(cè)吸光度，以30%乙醇溶液為空白，測(cè)定吸光度值。以吸光度值為Y軸坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/mL）為X軸坐標(biāo)。得出吸光度值（Y）與蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X）的直線回歸方程為Y=0.0103X-0.0009，R2= 0.9997。

1.3.2微波輔助酶法提取工藝

苦苣粉→溶解→調(diào)整酸堿度（pH）→纖維素酶酶解→加熱滅酶→加乙醇溶液→微波處理→離心→取上清液→測(cè)定吸光度→帶入公式計(jì)算苦苣黃酮提取率。

1.4　單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定料液比為1∶30、乙醇濃度為60%和pH為5的條件下，分別考察纖維素酶的量（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%）、酶解溫度（40、45、50、55 ℃和60 ℃）、酶解時(shí)間（60、80、100、120 min和140 min）對(duì)苦苣黃酮提取率的影響。

1.5　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別選取纖維素酶加入量、酶解溫度和酶解時(shí)間為考察因子，以苦苣黃酮的提取率為指標(biāo)，進(jìn)行酶解條件的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)選取L9(34)正交表，各因素水平見(jiàn)表1。

表1　酶解條件正交試驗(yàn)因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1　酶法提取工藝條件的確定

（1）纖維素酶的量對(duì)苦苣黃酮提取率的影響。由圖1可以得出，當(dāng)加入纖維素酶低于1.2%時(shí)，苦苣黃酮的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)纖維素酶濃度為1.2%時(shí)達(dá)到飽和，此時(shí)苦苣黃酮的提取率為最高。當(dāng)加入纖維素酶超過(guò)1.2%時(shí)，苦苣黃酮的提取率又逐漸減小。因此纖維素酶的用量可選擇在1.2%左右。

圖1　纖維素酶添加量對(duì)黃酮提取率的影響圖

（2）酶解溫度對(duì)苦苣黃酮提取率的影響。由圖2可以得出，當(dāng)酶解溫度不斷增高時(shí)，苦苣黃酮的提取率先逐漸增加，在50 ℃時(shí)呈現(xiàn)最大值，接著又逐漸減小。究其原因，纖維素酶的活性在50 ℃時(shí)達(dá)到最大，對(duì)苦苣的酶解處理效果也達(dá)到最好。因此，酶解的溫度可以選擇在50 ℃左右。

圖2　酶解溫度對(duì)黃酮提取率的影響圖

（3）酶解時(shí)間對(duì)苦苣黃酮提取率的影響。由圖3可得，當(dāng)酶解處理時(shí)間在60～140 min時(shí)，苦苣黃酮的提取率在逐漸增加。說(shuō)明在此酶解反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越能使纖維素酶的作用越充分。但當(dāng)酶解時(shí)間長(zhǎng)于100 min時(shí)，苦苣黃酮提取率曲線上升較明顯幅度較大。當(dāng)酶解時(shí)間短于100 min后，苦苣黃酮提取率變化不大，曲線上升不明顯。因此，可選擇酶解時(shí)間在100 min左右，即節(jié)能又省時(shí)。

圖3　酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響圖

2.2　酶法提取正交試驗(yàn)結(jié)果

酶解工藝條件的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　酶法提取正交試驗(yàn)結(jié)果表

由表2可以看出，酶法提取苦苣黃酮工藝中，酶解處理?xiàng)l件對(duì)苦苣黃酮提取率的影響大小順序?yàn)锳（纖維素酶的量）＞C（酶解時(shí)間）＞B（酶解溫度）。由極差分析得出，最佳酶解處理?xiàng)l件為A3B2C1，即所用纖維素酶的量為1.4%、酶解的溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為80 min，此時(shí)苦苣黃酮的提取率為4.553%。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)酶法提取苦苣黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得出酶法提取黃酮的最佳工藝條件為纖維素酶1.4%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間80 min，在此條件下，苦苣黃酮的提取率為4.553%。

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