超聲波提取-固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定沉積物中24種皮質(zhì)類(lèi)固醇激素

周永順, 龔 劍, 楊可欣, 林粲源, 吳翠琴, 張舒寒

(廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 珠江三角洲水質(zhì)安全與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省放射性核素污染控制與資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510006)

皮質(zhì)類(lèi)固醇激素(corticosteroids, CSs)是一類(lèi)由腎上腺皮質(zhì)所合成的重要激素,幾乎參與了人類(lèi)和動(dòng)物的所有生命活動(dòng)[1,2]。人工合成的CSs類(lèi)藥物被廣泛應(yīng)用于炎癥、免疫類(lèi)疾病治療[3,4],但長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致人體免疫力下降、肥胖等疾病[5]。CSs可通過(guò)人體和動(dòng)物的排泄、污水處理廠(chǎng)的不完全處理排放,并最終進(jìn)入天然水環(huán)境中。相關(guān)研究表明多種CSs普遍存在于環(huán)境水體中,可能已對(duì)水生系統(tǒng)造成不利影響[6,7]。與其他有機(jī)污染物一樣,CSs可通過(guò)吸附作用附著于懸浮顆粒上并隨之遷移,最終沉積到水底,富集于沉積物中;也可在水動(dòng)力或其他理化條件變化時(shí)重新釋放到水體,并通過(guò)生物富集和食物鏈的傳遞作用進(jìn)而危害生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康[8]。迄今為止,關(guān)于環(huán)境中CSs污染現(xiàn)狀的研究主要集中在地表水和污水處理廠(chǎng)上[9,10],而對(duì)于其在沉積物等天然固相介質(zhì)中的賦存狀況則鮮有報(bào)道[11]。

環(huán)境中CSs的殘留水平不高(μg/L至ng/L級(jí)),沉積物樣品基質(zhì)組成復(fù)雜,前處理難度較大,因此,目前關(guān)于沉積物中CSs的殘留分析方法仍十分有限。有關(guān)CSs在天然環(huán)境中的含量水平、污染特征等研究剛起步[9-11],對(duì)該類(lèi)污染物環(huán)境地球化學(xué)行為的認(rèn)識(shí)亦非常有限。這主要受制于缺少相關(guān)的分析方法,特別是缺少針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的環(huán)境介質(zhì)中CSs多殘留的痕量分析方法。Zhang等[12]測(cè)定了基質(zhì)較為復(fù)雜的市政污水中3種糖皮質(zhì)激素,然而該方法回收率較低,檢出限和定量限較高,且實(shí)際樣品中未能檢測(cè)出目標(biāo)物;Liu等[13]和Chen等[14]分析了水體顆粒物和沉積物中4～5種糖皮質(zhì)激素,僅有皮質(zhì)醇被檢出。雖然之前Liu等[15]、楊雷等[16]、Fan等[17]、Weizel等[18]開(kāi)展了沉積物和污泥中數(shù)十種類(lèi)固醇激素的監(jiān)測(cè),但就CSs而言該類(lèi)分析方法缺乏針對(duì)性和系統(tǒng)性。而且其目標(biāo)物僅包含5～12種糖皮質(zhì)激素,不僅未涉及鹽皮質(zhì)激素,也未能覆蓋大多常見(jiàn)常用的CSs。水環(huán)境中沉積物既是污染物的“匯”也是“源”,因此,有必要針對(duì)性地發(fā)展一套簡(jiǎn)便、靈敏的沉積物中CSs多殘留的痕量分析方法,并將其應(yīng)用到實(shí)際的環(huán)境監(jiān)測(cè)中,為更系統(tǒng)地研究CSs在環(huán)境多介質(zhì)中的賦存狀況和環(huán)境行為提供技術(shù)保障。

針對(duì)基質(zhì)更為復(fù)雜的環(huán)境沉積物,本研究在水樣分析方法[19]的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用超聲波輔助提取聯(lián)合固相萃取(SPE)技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理,并對(duì)提取液開(kāi)展二次深度凈化降低基質(zhì)干擾;重新對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,兼顧信號(hào)響應(yīng)和儀器耐受性。最終建立了一套利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)檢測(cè)沉積物中24種CSs的定量分析方法,并應(yīng)用于珠江沉積物的CSs測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1260 Infinity-6460 QQQ超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(UPLC-MS/MS, Agilent公司)及Agilent MassHunter定量分析軟件;Autotrace280全自動(dòng)固相萃取儀(美國(guó)Thermo公司); Rotavapor R-120旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司); EFAA-DC12氮吹儀(上海安譜公司); Oasis HLB SPE柱(500 mg, 6 mL, Waters公司); Silica SPE柱(500 mg, 6 mL, Waters公司); LC-NH2SPE柱(500 mg, 3 mL, Supelco公司)。

24種CSs標(biāo)準(zhǔn)樣品(見(jiàn)表1)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司,純度均大于98%; 5種同位素替代物標(biāo)準(zhǔn)品:氫化可的松-d4、地塞米松-d4、曲安奈德-13C3、布地奈德-d8、丙酸氟替卡松-d5均購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals公司,純度均大于95%;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、丙酮(HPLC級(jí),德國(guó)CNW公司);實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(電阻率18.25 MΩ·cm)。

實(shí)際樣品為珠江三角洲河流表層沉積物。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

首先稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液。取適量?jī)?chǔ)備液用甲醇稀釋配制成10 mg/L的24種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和10 mg/L的5種同位素替代物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后用甲醇逐級(jí)稀釋至質(zhì)量濃度為1.0～100 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液;另取適量的5種同位素替代物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液備用。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液置于冰箱-20 ℃避光儲(chǔ)存。

表 1 24種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for the 24 target compounds

1.3 樣品的采集與處理

用不銹鋼抓斗式采樣器從珠江三角洲河流采集表層(0～20 cm)沉積物樣品,轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室并置于-20 ℃冷凍保存至分析。

稱(chēng)取2.0 g經(jīng)冷凍干燥、研磨過(guò)篩的沉積物樣品置于50 mL具塞聚丙烯離心管中,加入0.5 g銅片、10 mL甲醇-丙酮(1∶1, v/v)、20 μL的內(nèi)標(biāo)工作液,混勻后超聲提取10 min,再以6 000 r/min速度離心10 min并收集上層清液。上述步驟重復(fù)3次并合并提取液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至1 mL后,溶于200 mL超純水中,溶液用于固相萃取。Oasis HLB小柱依次用6 mL乙酸乙酯、6 mL乙腈、12 mL超純水活化后,使用全自動(dòng)固相萃取儀以10 mL/min的流速將試樣溶液過(guò)柱。上樣完畢后,先用10 mL 10%(v/v)乙腈水溶液淋洗,接著氮吹干燥柱床,然后依次用6 mL乙酸乙酯-乙腈(1∶1, v/v)、6 mL乙酸乙酯洗脫。收集的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶于1 mL甲醇。用5 mL乙酸乙酯、5 mL甲醇活化LC-NH2小柱,再將甲醇濃縮液過(guò)柱凈化,用5 mL甲醇洗脫。用氮?dú)鈱⑾疵撘捍抵两刹⒁约状级ㄈ葜?.5 mL,待UPLC-MS/MS測(cè)定。

圖 1 提取試劑對(duì)24種皮質(zhì)類(lèi)固醇激素回收率的影響(n=5)Fig. 1 Effect of extracting solvents on recoveries of the 24 CSs (n=5)

1.4 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流動(dòng)相A: 0.1%(v/v)乙酸水溶液,流動(dòng)相B:乙腈;柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;梯度洗脫程序[19]: 0～8.0 min, 28%B; 8.0～8.1 min, 28%B ～ 40%B; 8.1～12.0 min, 40%B; 12.0～12.1 min, 40%B～60%B; 12.1～16.0 min, 60%B～70%B; 16.0～16.5 min, 70%B～100%B; 16.5～20.5 min, 100%B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源,正離子掃描模式(ESI+);霧化器壓力:276 kPa;脫溶劑氣流速:11 L/min;離子源溫度:300 ℃;毛細(xì)管電壓4 000 V;采集時(shí)間窗口(delta retention time)為1.2 min,采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)選擇性監(jiān)測(cè)掃描模式(DMRM)。優(yōu)化后的24種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

定量分析:為了有效監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過(guò)程的系統(tǒng)誤差,消減基質(zhì)效應(yīng)的影響,提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,本研究采用內(nèi)標(biāo)法定量。使用5種同位素替代物作為內(nèi)標(biāo)對(duì)24種目標(biāo)物進(jìn)行定量分析:皮質(zhì)醇-d4(No.1～6)、地塞米松-d4(No.7～12)、曲安奈德-13C3(No.13～18)、布地奈德-d8(No.19～20)、丙酸氟替卡松-d5(No.21～24)(括號(hào)中為其對(duì)應(yīng)的表1中目標(biāo)物的編號(hào))。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

選擇合適的萃取溶劑能夠提高目標(biāo)物的提取效率同時(shí)減少雜質(zhì)干擾?？紤]到目標(biāo)化合物種類(lèi)較多、極性范圍較大且沉積物樣品基質(zhì)復(fù)雜等特點(diǎn),本研究選取弱、中、強(qiáng)極性的3種常用溶劑乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙腈(1∶1, v/v)以及甲醇-丙酮(1∶1, v/v),用于樣品超聲萃取并比較其提取效率。

3種溶劑萃取加標(biāo)樣品的回收率結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢钥闯?樣品經(jīng)乙酸乙酯溶劑提取后,所有目標(biāo)物均被檢出,回收率為8.58%～154.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.28%～40.8%;乙酸乙酯-乙腈(1∶1, v/v)的提取液中未能檢測(cè)出曲安西龍,其余目標(biāo)物回收率為6.19%～172.2%,RSD為0.64%～21.3%;樣品經(jīng)甲醇-丙酮(1∶1, v/v)提取后所有目標(biāo)物均被檢出,回收率為71.7%～130.2%,RSD為1.1%～9.7%。與前兩者相比,甲醇-丙酮(1∶1, v/v)作為提取溶劑具有較高的回收率和重復(fù)性。因此本研究選擇甲醇-丙酮(1∶1, v/v)作為超聲萃取溶劑。

2.2 SPE凈化條件的選擇及優(yōu)化

沉積物樣品基質(zhì)復(fù)雜,其提取液中難免含有大量的干擾物,不但影響儀器分析的準(zhǔn)確性,還會(huì)縮短分離柱的使用壽命[20]。因此為盡量降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,本研究考察了Silica柱和LC-NH2柱對(duì)SPE濃縮液作進(jìn)一步凈化的效果。其中Silica柱是以硅膠為基質(zhì)的極性吸附劑,主要用于分離非水溶液中的低極性組分[21],通過(guò)增加極性高的洗脫溶劑將結(jié)構(gòu)相似的化合物分開(kāi);LC-NH2柱是以氨丙基為基質(zhì)的中等極性吸附劑,能夠從極性溶液中萃取非極性化合物,與Silica柱一樣適用于分離異構(gòu)體[22]。

圖 2 SPE凈化條件對(duì)24種皮質(zhì)類(lèi)固醇激素回收率的影響(n=5)Fig. 2 Effect of SPE purification conditions on recoveries of the 24 CSs (n=5)

基于先前的研究[9],采用Oasis HLB SPE柱對(duì)樣品提取液進(jìn)行富集并用10 mL的10%乙腈水溶液洗柱,作為第一次凈化。接著再分別用上述兩種凈化柱對(duì)HLB柱洗脫液進(jìn)行第二次凈化:(1)洗脫液濃縮后溶于1 mL乙酸乙酯-正己烷(1∶9, v/v),并轉(zhuǎn)移至活化的Silica柱,并用3 mL乙酸乙酯-正己烷(1∶9, v/v)淋洗,最后用4 mL乙酸乙酯-甲醇(95∶5, v/v)洗脫,洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、溫和氮?dú)獯蹈珊笥眉状级ㄈ?待測(cè);(2)洗脫液濃縮后溶于1 mL甲醇,并轉(zhuǎn)移至活化的LC-NH2柱,用5 mL甲醇洗脫LC-NH2柱,洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、溫和氮?dú)獯蹈?甲醇定容后待測(cè)。通過(guò)比較只經(jīng)過(guò)HLB柱一次凈化以及分別再經(jīng)Silica柱、LC-NH2柱二次凈化的3種情況,對(duì)凈化效果進(jìn)行綜合評(píng)估。

3種凈化條件下目標(biāo)物回收率結(jié)果如圖2所示。樣品僅經(jīng)過(guò)HLB柱一次凈化時(shí),目標(biāo)化合物的回收率普遍偏低(25.5%～95.9%)且RSD范圍較大(11.1%～42.0%),重現(xiàn)性較差。濃縮液經(jīng)Silica柱二次凈化后,目標(biāo)物之一曲安西龍并未檢出,可能與其在硅膠柱中保留較強(qiáng),不易被洗脫下來(lái)有關(guān)。其余目標(biāo)化合物的回收率為52.7%～94.7%, RSD為0.9%～8.6%。濃縮液經(jīng)LC-NH2柱二次凈化后,所有目標(biāo)化合物均被檢出,回收率為61.4%～118.4%, RSD為0.8%～6.5%?？梢?jiàn)其凈化效果優(yōu)于前兩種情況且回收率高、重現(xiàn)性較好。對(duì)比濃縮液經(jīng)過(guò)LC-NH2柱凈化前后代表性化合物的信號(hào)響應(yīng)(見(jiàn)圖3)發(fā)現(xiàn),凈化后的樣品中基質(zhì)干擾明顯降低,目標(biāo)物信號(hào)增強(qiáng)。因此本研究選用LC-NH2柱對(duì)樣品進(jìn)行二次凈化。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

CSs是典型的甾體類(lèi)化合物,其基本結(jié)構(gòu)如圖4所示?；衔镌贑-17、C-20和C-21處存在酮基或羥基,能夠在ESI-模式下離子化,產(chǎn)生的母離子為[M+HCOO]-;在C-3處存在共軛羰基等多電子基團(tuán),所以在ESI+模式下能形成[M+H]+母離子。因此CSs可以在正、負(fù)兩種電離模式下檢測(cè)到。通過(guò)單標(biāo)溶液進(jìn)樣,分別對(duì)24種目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。首先,通過(guò)母離子的全掃描(full scan)確定化合物的準(zhǔn)分子離子,然后在選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式下優(yōu)化碎裂電壓和毛細(xì)管電壓,使[M+H]+或[M+HCOO]-響應(yīng)達(dá)到最大;然后對(duì)母離子作子離子全掃描(product ion scan),選擇2個(gè)具有更高豐度的特征碎片離子,優(yōu)化碰撞能量以使響應(yīng)最大化,最后獲得響應(yīng)最佳的兩對(duì)MRM離子對(duì)和相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)。

圖 3 氟尼縮松、醋酸氟氫可的松、皮質(zhì)酮、丙酸氯倍他索和丁酸倍他松經(jīng)LC-NH2 SPE柱凈化前、后的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of flunisolide, fludrocortisone acetate, corticosterone, clobetasol propionate and clobetasone butyrate before and after purified by LC-NH2 cartridges

圖 4 皮質(zhì)類(lèi)固醇激素的結(jié)構(gòu)骨架Fig. 4 Structural features of corticosteroids

圖 5 24種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)在(a)正離子模式、(b)負(fù)離子模式、和(c)正負(fù)離子模式下的總離子色譜圖Fig. 5 Total ion chromatograms (TIC) of the 24 target compounds at mass concentration of 20 μg/L in (a) positive ion mode, (b) negative ion mode, and (c) positive and negative ion mode For peak Nos., see Table 1.

分別在ESI-、ESI+和ESI±模式下,對(duì)24種目標(biāo)物的特征離子進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在ESI-模式下,皮質(zhì)醇、潑尼松、皮質(zhì)酮等十幾種目標(biāo)物的信號(hào)強(qiáng)度過(guò)低[23];在ESI+模式下的大部分化合物基峰的相對(duì)豐度比ESI±模式高出2～6倍(見(jiàn)圖5)。另外,考慮到ESI±模式下須使用導(dǎo)電毛細(xì)管,與ESI+模式下使用的石英毛細(xì)管相比,其耐臟程度低、使用壽命也較短。因此,本研究選擇石英毛細(xì)管并在ESI+下對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

沉積物樣品基質(zhì)復(fù)雜,進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)易受到基質(zhì)干擾,影響方法的靈敏度和重現(xiàn)性。本研究采用向沉積物提取液和純?nèi)軇┲屑訕?biāo)的方式評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(ME)的影響,計(jì)算公式如下[24]:ME=(1-扣除本底后基質(zhì)溶液中目標(biāo)物的響應(yīng)值/純?nèi)軇┲邢鄳?yīng)目標(biāo)物的響應(yīng)值)×100%。

結(jié)果(見(jiàn)表2)發(fā)現(xiàn),沉積物樣品在未經(jīng)LC-NH2柱凈化的條件下,目標(biāo)物受基質(zhì)干擾的影響大,ME值范圍在-7.7%～74.5%之間,大部分化合物表現(xiàn)為較強(qiáng)的基質(zhì)抑制作用;利用LC-NH2柱對(duì)沉積物樣品進(jìn)行凈化后,ME值范圍為-7.9%～27.9%,大多數(shù)目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)在±20%以?xún)?nèi),表明該凈化步驟可有效降低基質(zhì)干擾。為進(jìn)一步消減基質(zhì)效應(yīng)的影響,本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。這不但能有效監(jiān)控分析過(guò)程,消除系統(tǒng)誤差,也保證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程、檢出限和定量限

配制1.0～100 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)加入5種同位素內(nèi)標(biāo),質(zhì)量濃度均為10 μg/L。按照濃度由低到高依次進(jìn)樣,以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積比值為縱坐標(biāo)，待測(cè)物的質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。24種CSs具有良好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995。按信噪比(S/N)=3和S/N=10計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),所有化合物的LOD和LOQ分別在0.14～1.25 μg/kg和0.26～2.26 μg/kg范圍內(nèi)(見(jiàn)表2)。

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

依據(jù)目前有限的報(bào)道[11],沉積物中CSs的含量約為類(lèi)固醇雌激素的幾倍至數(shù)十倍,而珠江流域沉積物中的類(lèi)固醇雌激素殘留普遍在幾個(gè)μg/kg水平[25]。因此,本文分別設(shè)定了5、20、50 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平,取2 g沉積物并添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定5次。結(jié)果如表3所示,樣品平均加標(biāo)回收率(n=5)為64.9%～125.1%, RSD(n=5)為0.4%～12.6%,均滿(mǎn)足環(huán)境樣品有機(jī)物痕量檢測(cè)要求。

表 2 24種目標(biāo)化合物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs) and matrix effects (MEs) for the 24 target compounds

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用所建立的方法分析了3份取自珠江三角洲河流的沉積物樣品,24種CSs測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。樣品中共有11種目標(biāo)物(曲安西龍、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸氟輕松、氟米龍、氟尼縮松、醋酸脫氧皮質(zhì)酮、丙酸氯倍他索、丙酸氟替卡松和丁酸氯倍他松)被檢出,含量范圍為1.25～29.38 μg/kg。

表 4 珠江三角洲河流沉積物樣品中的皮質(zhì)類(lèi)固醇激素含量Table 4 Contents of corticosteroids in the sediment sample from the rivers of Pearl River Delta μg/kg

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于超聲波提取-固相萃取技術(shù)對(duì)沉積物樣進(jìn)行前處理,應(yīng)用UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)沉積物中24種CSs的分析方法。該方法具有靈敏、準(zhǔn)確和重現(xiàn)性好等特點(diǎn),滿(mǎn)足對(duì)沉積物中多種天然和合成CSs的痕量監(jiān)測(cè)要求,可廣泛應(yīng)用到該類(lèi)污染物環(huán)境行為和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的研究中。