多西環(huán)素對心肌梗死模型大鼠縫隙連接蛋白43表達的影響

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心肌梗死是一種常見的心臟疾病，這種疾病的發(fā)病機制較復雜，與較多因素有關，心肌梗死后易出現(xiàn)心室重構，心室重構誘發(fā)心功能衰竭。在醫(yī)療技術迅速發(fā)展形勢下，心肌梗死病人得到有效治療，相應的死亡率逐漸降低，但相應的心功能不全發(fā)生率未有效降低[1]。心肌梗死對病人的健康造成較大危害，易導致死亡。心臟病發(fā)展至一定階段后易出現(xiàn)心肌梗死，約一半病人可能由于突發(fā)致死性室性心律失常導致死亡[2-4]。心肌梗死的發(fā)病機制與心肌電重構密切相關，心肌梗死過程出現(xiàn)明顯的心肌電生理重構，重構期間產(chǎn)生相應的細胞膜離子通道變化，嚴重者可能出現(xiàn)相應的細胞間縫隙連接變化。相關研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白43(Cx43)明顯影響心肌電生理重構過程，與此相關的研究引起學者關注。很多學者建立心肌梗死動物模型進行研究，模型中發(fā)現(xiàn)明顯的縫隙連接重構，且表現(xiàn)為一定程度的心肌電生理失穩(wěn)[5-6]。

心肌梗死后病人心肌多種基質金屬蛋白酶(MMPs)活性出現(xiàn)明顯變化，其中基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)活性顯著升高。這些蛋白酶活性升高后進一步導致心肌梗死后左室重構，造成病人的心功能損害。心肌梗死治療常用多西環(huán)素，該藥物屬于一種廣譜的MMPs抑制劑，其與MMPs活性中心結合，降低MMPs表達水平并降低MMP活性。相關研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素可顯著抑制MMP-9表達，并對惡性心律失常有一定改善作用，具體機制尚不確定[7]。本研究建立相應的主動脈縮窄性心肌梗死大鼠模型，觀察心室肌Cx43表達的變化及多西環(huán)素對C43表達的影響。

1　材料與方法

1.1模型制作與分組選擇SPF級健康Wistar大鼠，雌雄不限，體重200 g～300 g，均購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心。將大鼠分為模型組和假手術組，依據(jù)相關文獻資料制備相應的心肌梗死大鼠模型，將大鼠固定后備皮，連接心電圖之后進行觀察。模型組在大鼠左胸第三、四肋間切開1 cm3小口，同時輕提左心耳，之后選擇5/0手術線結扎左冠狀動脈前降支，關閉胸口縫合處理，觀察心電圖，若看到相應ST段顯著抬高可判斷結扎成功。假手術組只穿線，不結扎，手術1個月后檢測其血流動力學。對部分模型組大鼠進行多西環(huán)素組注射治療，而對其余心肌梗死組大鼠注入生理鹽水，持續(xù)時間為4周。

1.2取材配制10%水合氯醛溶液后對大鼠進行麻醉，之后將其呈仰臥位姿勢固定之后進行解剖處理。每組選取一定比例大鼠并直接取出心臟，進行預冷處理并清洗后冷凍保存，測定其心肌和蛋白表達情況。對另一部分大鼠心臟進行灌注固定處理，配制0.85%生理鹽水，通過針頭灌注，同時注入一定濃度肝素2 mL，短時間內剪斷下腔靜脈使血液流出，等待一段時間后，灌注4%多聚甲醛300 mL。取出心臟放置一段時間后通過磷酸緩沖鹽溶液沖洗，之后進行梯度酒精脫水并包埋處理，觀察Cx43蛋白表達情況。

1.3心肌Cx43 mRNA表達測定檢測3組Cx43 mRNA表達情況，采用熒光定量PCR方法測定，之后提取出總RNA，之后進行熒光定量PCR。反應體系包括組分較多，主要有10×PCR緩沖液、Taq聚合酶和cDNA組成。具體反應步驟：在95 ℃環(huán)境下進行1個PCR循環(huán)，持續(xù)時間為3 min；在類似條件下進行40個PCR循環(huán)。接著通過儀器定量PCR檢測。

1.4心肌Cx43蛋白表達檢測取出相應心肌組織勻漿，進行離心處理后取出上清，之后煮沸并電泳處理，并加入一定量的Cx43。洗膜之后進行室溫振蕩孵育，顯色處理。通過灰度值比值確定相應Cx43的蛋白水平。

1.5心肌Cx43免疫組織化學染色分析通過免疫組織化學SABC法確定心肌蛋白的定位表達，制定切片后進行脫蠟、漂洗處理，孵育一段時間后滴加一抗孵育，將培養(yǎng)液放置在室溫環(huán)境下進行PBS漂洗，加入生物素化二抗之后放在溫室環(huán)境下孵育，加入SABC，進行相應顯色、脫水處理。

2　結　果

2.13組大鼠心肌Cx43 mRNA表達比較3組大鼠心肌組織取材提取mRNA，進行熒光定量測定發(fā)現(xiàn)，心肌梗死組Cx43 mRNA表達與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；多西環(huán)素組治療后Cx43 mRNA表達提高，與心肌梗死組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1、圖1。

表1　3組大鼠心肌Cx43 mRNA表達比較(±s)

注：與假手術組比較，**P<0.05。

圖1心肌Cx43 mRNA表達

2.23組大鼠心肌Cx43表達量比較多西環(huán)素組表達量高于心肌梗死組(P<0.05)；但多西環(huán)素組Cx43表達量低于假手術組(P<0.05)。詳見表2、圖2。

表2　3組大鼠心肌Cx43表達量比較(±s)

圖2心肌Cx43表達量圖譜

2.3心肌Cx43免疫組織化學染色分析免疫陽性反應呈棕褐色，多西環(huán)素組心肌Cx43蛋白表達量高于心肌梗死組(P<0.05)，但低于假手術組(P<0.05)。詳見圖3、表3。

圖3　心肌Cx43免疫組織化學染色分析圖

3　討　論

急性心肌梗死是一種常見的心臟疾病，導致心肌重構，這種重構和降解代謝失衡密切相關，且出現(xiàn)相應的心肌細胞電生理變化；心肌梗死的持續(xù)改變主要表現(xiàn)為心室重塑，包括左心室體積增大、形態(tài)改變及梗死節(jié)段心肌變薄和非梗死節(jié)段心肌增厚，這種改變對心室的收縮效應及電活動均有影響。不斷肥大的心室和減慢的電傳導速率與電沖動的異位起搏密切相關。

心臟縫隙連接蛋白是連接兩個相鄰細胞質的聚體通道，縫隙連接蛋白是小于1 kDa特殊小分子物質、代謝產(chǎn)物、離子的交換通道，是兩個相鄰心肌細胞的電偶聯(lián)通道。目前發(fā)現(xiàn)心肌表達量較高的3種縫隙連接蛋白亞型分別是Cx40、Cx45和Cx43。哺乳動物Cx43是心室肌重要的縫隙連接蛋白；Cx43和心肌細胞之間的信息傳遞密切相關，且在保持心肌組織整體性和收縮性能方面有重要作用。破壞心肌細胞的聯(lián)系常引起相應Cx43數(shù)量減少，在一定條件下易導致猝死；Cx43基因轉基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)減少心室縫隙連接的偶聯(lián)易誘發(fā)室性心律失常；縫隙連接蛋白基因轉基因小鼠研究證據(jù)發(fā)現(xiàn)減少心室縫隙連接的偶聯(lián)易誘發(fā)室性心律失常。

相關研究發(fā)現(xiàn)，MMPs不僅在細胞基質降解過程起重要作用，且影響膠原合成的調節(jié)過程，導致相應的MMPs表達明顯變化。細胞外基質的積累增多會使相應的心肌細胞間距增加，引起相應的心肌細胞失偶聯(lián)。MMPs在心肌細胞基質合成過程起到一定作用，與之相關的Cx43蛋白明顯影響心肌細胞的電傳導過程。相關研究發(fā)現(xiàn)，若氧含量不足導致乳鼠心肌細胞Cx43表達量下降，在此情況下出現(xiàn)相應惡性心律失常，并導致Cx43表達下降[8-10]。

多西環(huán)素是一種常用的四環(huán)素類抗生素，在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中對MMP抑制方面有重要作用，其與MMP活性中心結合并抑制后者的轉錄過程，降低MMP表達水平，且抑制MMPs活性[11-13]。Cx43含量減少延長心肌愈合時間并導致一定程度的心律失常；MMPs降解心肌細胞基質并在一定條件下誘發(fā)心律失常；多西環(huán)素保護大鼠心肌梗死區(qū)域的縫隙連接蛋白影響左室重塑、提高心室功能，且降低梗死后對室性心律失常的易感性[14-16]。

本研究過程發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心肌Cx43蛋白表達量顯著降低，多西環(huán)素治療后可提高Cx43表達，提示多西環(huán)素治療心肌梗死具有一定的療效。

參考文獻：

[1] 李鎮(zhèn)，嚴激，徐健，等.多西環(huán)素對離體大鼠心肌缺血再灌注后縫隙連接分布及心律失常的影響[J].安徽醫(yī)藥，2011，11(8)：941-944.

[2] 郁秀娟.多西環(huán)素抑制基質金屬蛋白酶對心肌梗死大鼠左室重構和心功能的影響[D].合肥：安徽醫(yī)科大學，2013.

[3] He Q，Qin S，Ma K，et al.Effects of simvastatin on angiogenesis and the expression of Ang1 after myocardial infarction in rats[J].Heart，2010，96(Suppl 3)：A14.

[4] Ma D，F(xiàn)u L，Shen J，et al.Interventional effect of valsartan on expression of inducible cAMP early repressor and phosphodiesterase 3A in rats after myocardial infarction[J].European Journal of Pharmacology，2009，602(2/3)：348-354.

[5] Zhang P，Yang YJ，Chen X，et al.Effects of doxycycline on the expression of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of MMP in myocardium after acute myocardial infarction； an animal experiment with rats[J].National Medical Journal of China，2004，84(15)：1288-1293.

[6] Jiang Z，Qin S，Yu Y.Effect of simvastatin on osteopontin expression and its correlation with ventricular remodeling in rats after myocardial infarction[J].Journal of Third Military Medical University，2011，33(23)：2508-2511.

[7] 楊少華.N-乙酰半胱氨酸改善大鼠心肌梗死后心室重構的研究[D].南京：南京醫(yī)科大學，2012.

[8] 許小媛.大鼠骨髓基質干細胞向心肌細胞的誘導分化與移植治療心肌梗死的實驗研究[D].揚州：揚州大學，2011.

[9] Li HB，Chen SJ，Hu JH，et al.Effects of Tongxinluo on connexin 43 remodeling and ventricular arrhythmia after myocardial infarction in rats[J].Chinese Journal of Pathophysiology，2015，31(2)：274-278.

[10]Wang Y，Liu X，Zhang D，et al.The effects of apoptosis vulnerability markers on the myocardium in depression after myocardial infarction[J].Bmc Medicine，2013，11(1)：32-35.

[11]韓雪嬌.多西環(huán)素對哮喘大鼠VEGF、MMP-9的作用及血管重塑的影響[D].石家莊：河北醫(yī)科大學，2013.

[12]Wu X，Huang W，Luo G，et al.Hypoxia induces connexin 43 dysregulation by modulating matrix metalloproteinases via MAPK signaling[J].Molecular & Cellular Biochemistry，2013，384(1/2)：155-162.

[13]Li ZY，Wang M，Zhang Y，et al.The effect of the left stellate ganglion on sympathetic neural remodeling of the left atrium in rats following myocardial infarction[J].Pacing & Clinical Electrophysiology，2015，38(1)：107-114.

[14]王越，巫相宏，黃文，等.多西環(huán)素對大鼠急性心肌梗死后轉化生長因子-β1表達及心肌細胞凋亡的影響[J].中國當代醫(yī)藥，2015(11)：4-7；11.

[15]Guo WH，Zhang WW，Huang YH.Effect of Baimai ointment on the expression of p38MAPK and GAP-43 in ischemic brain of rats[J].Beijing Medical Journal，2009，31(1)：41-44.

[16]Imanishi Y，Miyagawa S，Kitagawa-Sakakida S，et al.Tongue muscle-derived stem cells express connexin 43 and improve cardiac remodeling and survival after myocardial infarction in mice[J].Circulation Journal Official Journal of the Japanese Circulation Society，2010，74(6)：1219-1226.