一例耐藥嚴(yán)重的大腸桿菌和輪狀病毒混合感染案例

殷鑫歡，楊曉宇，徐 雷，王佳煜，李原野，徐志文，2，朱 玲，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）

豬輪狀病毒（Porcine rotavirus,PoRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis,TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea,PEDV）是引起仔豬腹瀉的主要3種病毒。其中豬輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rota-virus），豬的輪狀病毒多發(fā)于每年的12月至翌年的1、2月份，夏季也有該病暴發(fā)的報(bào)道。并且各種年齡、性別的豬都可以感染輪狀病毒，尤其以仔豬感染最為嚴(yán)重，1周齡以內(nèi)的仔豬在無母源抗體的保護(hù)下感染，隨著年齡的增長(zhǎng)，豬感染輪狀病毒的癥狀有所減輕。研究報(bào)道，豬輪狀病毒常和大腸桿菌、沙門氏菌等混合感染，且與豬流行性腹瀉病毒混合感染引起的腸道損傷比單一感染造成的損傷更為嚴(yán)重。PoRV存在多種血清型，各血清型之間無交叉保護(hù)或交叉保護(hù)性很差。資料顯示，我國(guó)豬群中輪狀病毒的感染以A群為主，在A群中VP7是中和抗原基因，它編碼輪狀病毒外殼上主要糖蛋白和中和抗原蛋白，在各毒株中高度保守。

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬的一種急性傳染病，主要表現(xiàn)為腸炎、腸敗毒血癥等多種臨床癥狀，世界各地均有發(fā)生，造成新生仔豬大批死亡或生長(zhǎng)不良。豬大腸桿菌由于豬的生長(zhǎng)期和引起發(fā)病的血清型的差異，可將疾病分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫。傳播途徑主要是母豬糞便中排出的致病性大腸桿菌，污染母豬的皮膚與周圍環(huán)境，仔豬通過吃乳和舔吮母豬的皮膚而感染。但是疾病的發(fā)生與周圍環(huán)境、衛(wèi)生條件以及哺乳母豬的體質(zhì)存在著密切的關(guān)系。由于畜牧獸醫(yī)上常使用抗生素作為促生長(zhǎng)劑以提高生產(chǎn)效益，并且我國(guó)在獸用藥物的生產(chǎn)管理上還不規(guī)范，抗生素的使用很不規(guī)范，很多頭孢三四代藥物直接就使用，而沒有使用有效果的頭孢一二代，一些平時(shí)比較簡(jiǎn)單的臨床癥狀直接就使用抗生素，導(dǎo)致發(fā)病時(shí)抗生素的使用效果較差。

1 發(fā)病情況、臨床癥狀和剖解癥狀

2017年，四川省綿陽市某豬場(chǎng)的產(chǎn)房小豬普遍發(fā)生黃色水樣腹瀉，外觀表現(xiàn)為小豬被毛凌亂，耳部發(fā)紺，消瘦，通過解剖發(fā)現(xiàn)肺臟、肝臟沒有什么特殊癥狀，主要就是腸道積滿了黃色的水樣物，結(jié)合臨床癥狀，診斷為PoRV和大腸桿菌混合感染。通過對(duì)從肝臟和小腸腹瀉物中分離的大腸桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該大腸桿菌耐藥嚴(yán)重，20多種檢測(cè)的藥物之中，百分之九十都耐藥，耐藥情況比較嚴(yán)重。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

病料（2頭腹瀉仔豬，分別用編號(hào)1和2來代替）送至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 試驗(yàn)試劑

DNA、RNA提取試劑盒，Taq DNA聚合酶，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa公司，引物均由上海Sangon生物工程公司合成。

2.3 試驗(yàn)器材

美國(guó)Thermo Micro21R微量離心機(jī)購(gòu)自賽默飛成都分公司；PCR儀購(gòu)自成都伯樂科技有限公司。

2.4 檢測(cè)方法

（1）取樣小腸腹瀉段研磨提取病料中的RNA和DNA，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR檢測(cè) PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV（豬德爾塔冠狀病毒），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR方法檢測(cè)PRV（豬偽狂犬病病毒）、PCV2（圓環(huán)病毒2型）。試驗(yàn)方法均按照試劑盒說明書操作，所用引物如下。

根據(jù)GenBank已發(fā)表的上述病毒的序列，采用本實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)通用引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）進(jìn)行RT-PCR和PCR檢測(cè)。

表1 PCR引物序列

（2）采取病豬的肝臟和小腸黃色腹瀉物分別劃線麥康凱培養(yǎng)基，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，12 h后均長(zhǎng)出了紅色的菌落，即為大腸桿菌，染色觀察為單個(gè)存在的革蘭氏陰性桿菌，挑取單個(gè)菌落接種LB肉湯置于細(xì)菌搖床37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。0.2 mL/只腹腔注射小白鼠，結(jié)果小鼠同樣表現(xiàn)出腹瀉，黏附墊料并且于24 h內(nèi)死亡，解剖之后肝臟同樣能夠分離到大腸桿菌。

3 結(jié)果與防治措施

（1）通過對(duì)幾種能夠引起腹瀉的病毒檢測(cè)，這次病例中只有PoRV檢測(cè)為陽性，條帶大小為308 bp，圖1中檢測(cè)的兩頭豬中1號(hào)為PoRV陽性，2號(hào)沒有檢測(cè)出PoRV，圖1中分別設(shè)置陰陽性對(duì)照，證明本試驗(yàn)是成立的。

圖1 兩份病豬樣品PoRV電泳結(jié)果

（2）大腸桿菌的藥敏結(jié)果見表2，參照標(biāo)準(zhǔn)為藥品試驗(yàn)紙片抑制法，由杭州天河微生物試劑有限公司采用美國(guó)NCCLS最新藥敏試驗(yàn)法規(guī)制備的標(biāo)準(zhǔn)厚紙片，紙片直徑（6.0±0.05）mm，紙片含藥量符合標(biāo)準(zhǔn)。

表2 大腸桿菌藥敏結(jié)果

（3）針對(duì)檢測(cè)結(jié)果，采取防治措施：①免疫接種。對(duì)仔豬使用豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒弱毒疫苗（哈爾濱獸醫(yī)研究所研制）進(jìn)行免疫預(yù)防，新生仔豬可在吮乳前肌注傳染性胃腸炎、輪狀病毒二聯(lián)弱毒疫苗1 mL，至少經(jīng)過30 min才能再吮乳，并在斷奶前7～10 d肌內(nèi)注射2 mL，才能夠持續(xù)保護(hù)6個(gè)月，妊娠母豬可分別在分娩前5～6周和1周肌內(nèi)注射1 mL。②要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，豬場(chǎng)嚴(yán)格采取全進(jìn)全出制，從確保沒有感染疾病的地方引進(jìn)豬群，豬圈要經(jīng)常清掃，且飼養(yǎng)不同批次的豬圈必須經(jīng)過全面徹底的消毒處理。③豬場(chǎng)應(yīng)該合理使用抗生素，并且避免直接使用規(guī)格較高的像頭孢三四代藥物，也不能頻繁使用抗生素，至于在飼料里面添加的預(yù)防類的抗生素可以隔一段時(shí)間換一下，避免菌株產(chǎn)生耐藥性以致于后面使用抗生素沒有什么作用，像這次分離的大腸桿菌就是耐藥性特別嚴(yán)重，上述的藥物對(duì)它都沒有什么效果或者完全耐藥，因此在臨床中一定要合理使用抗生素。此外，仔豬在斷奶階段可以服用一些微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)仔豬腸道菌群平衡，以抑制致病性大腸桿菌的增殖。

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