結(jié)腸癌組織中Notch1、NF-κB、uPA及p-Akt的表達(dá)變化及意義

趙雪,高玉彤

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)惡性腫瘤，同時(shí)亦是預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，在全球腫瘤死亡原因中位居第二位，是癌癥相關(guān)死亡的第五大常見(jiàn)原因[1,2]。近年來(lái)，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。盡管結(jié)直腸鏡的廣泛使用使得部分早期腫瘤患者獲得較好的預(yù)后，但對(duì)于多數(shù)中晚期結(jié)直腸癌患者而言，預(yù)后并未明顯改善。最近有研究表明，Notch信號(hào)通路及PI3K-AKt信號(hào)通路的過(guò)度活化會(huì)激活其共同的下游信號(hào)分子核因子κB(NF-κB)，從而參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3，4]。尿激酶介導(dǎo)的纖溶酶原激活物(uPA)是一種絲氨酸蛋白酶，能催化無(wú)活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶，降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，從而參與癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移，但uPA與結(jié)直腸癌的相關(guān)研究甚少。2017年3～9月，我們應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)Notch1、NF-κB、uPA 和p-Akt在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤和正常黏膜組織中的表達(dá)，探討這些指標(biāo)在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2010年1月～2016年9月存檔于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科的結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本86例，其中患者男37例、女49例；年齡40～91歲，中位年齡71.5歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；Dukes分期：A+B期30例，C+D期56例；侵出漿膜者49例，未侵出漿膜者37例；組織學(xué)分級(jí)：高分化腺癌33例，中分化腺癌39例，低分化腺癌14例；結(jié)腸腺瘤手術(shù)標(biāo)本25例，其中患者男11例、女14例，年齡49～77歲，中位年齡61歲。選取相應(yīng)結(jié)腸切緣(距離癌組織>50 mm)正常黏膜30例作為對(duì)照。每例標(biāo)本的病理均經(jīng)資深病理醫(yī)師重新復(fù)核，確保診斷的正確性。

1.2Notch1、NF-κB、uPA 、p-Akt表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化PV兩步法。小鼠抗人Notch1單克隆抗體(濃縮型)、兔抗人NF-κB多克隆抗體(濃縮型)、兔抗人p-Akt單克隆抗體(濃縮型)購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人uPA多克隆抗體(濃縮型)購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；PV-6000 通用型兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒及 DAB 顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用蠟塊均做4 μm厚的連續(xù)切片，將切片附于載玻片上，置于66～70 ℃的烤箱中烤蠟1.5～2 h，常規(guī)脫蠟至水，參照PV-6000通用型兩步法免疫組織化學(xué)染色說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照，以PBS代替一抗 。 Notch1抗體稀釋濃度為1∶250，細(xì)胞定位：細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜；NF-κB抗體稀釋濃度為1∶250，細(xì)胞定位：細(xì)胞質(zhì)；uPA抗體稀釋濃度為1∶300，細(xì)胞定位：細(xì)胞質(zhì)，這三種抗體的修復(fù)方法為PBS磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)，微波爐，3 min×2次。p-Akt抗體稀釋濃度為1∶100，細(xì)胞定位：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，修復(fù)方法為T(mén)ris/EDTA修復(fù)液(pH 8.0)，微波爐，3 min×2次。參照文獻(xiàn)[5～7]對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定：每例切片選取 5 個(gè)具有代表性的高倍(×400倍)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，同時(shí)評(píng)估陽(yáng)性信號(hào)的染色強(qiáng)度。計(jì)分和強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比≤10%計(jì)1分、11%～50%計(jì)2分、51%～75%計(jì)3分、>75%計(jì)4分；無(wú)特異性著色計(jì)0分、淺棕色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分;將陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分與染色強(qiáng)度得分相乘結(jié)果作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0～1分計(jì)陰性(-)；2～3分為弱陽(yáng)性(+)；4～6分為陽(yáng)性(++)；7～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++),+～+++均為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。免疫組化染色結(jié)果分析采用χ2檢驗(yàn)；各指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1結(jié)腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織中Notch1、NF-κB、uPA和p-Akt表達(dá)比較Notch1、NF-κB、uPA和p-Akt在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌組織中表達(dá)率均呈遞增趨勢(shì)。Notch1在正常腸黏膜、腺瘤和結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性率依次為36.67%(11/30)、36.00%(9/25)、65.12%(56/86)。Notch1在結(jié)腸癌中的表達(dá)率高于腺瘤和正常腸黏膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);Notch1在正常腸黏膜和腺瘤中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.959)。NF-κB在正常腸黏膜、腺瘤和結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性率依次為30.00%(9/30)、32.00%(8/25)、63.95%(55/86)。NF-κB在結(jié)腸癌中的表達(dá)高于腺瘤和正常腸黏膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);NF-κB 在正常腸黏膜和腺瘤中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.873)。uPA在正常腸黏膜、腺瘤和結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性率依次為23.33%(7/30)、40.00%(10/25)、70.93%(61/86)，uPA在結(jié)腸癌中的表達(dá)率高于腺瘤和正常腸黏膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；uPA在正常腸黏膜和腺瘤中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.183);p-Akt在正常腸黏膜、腺瘤和結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性率依次為23.33%(7/30)、36.00%(9/25)、59.30%(51/86)，p-Akt在結(jié)腸癌中的表達(dá)率高于腺瘤和正常腸黏膜(P均<0.05)；p-Akt在正常腸黏膜和腺瘤中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.303)。

2.2Notch1、NF-κB、uPA 和p-Akt表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Notch1、NF-κB、uPA和p-Akt在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和Duke's分期相關(guān)(P均<0.05)；與患者的年齡、性別無(wú)關(guān)(P均>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　Notch1、NF-κB、uPA 和p-Akt表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3相關(guān)性分析結(jié)腸癌組織中Notch1和p-Akt、Notch1和NF-κB、NF-κB和uPA及p-Akt和NF-κB陽(yáng)性表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.225、0.434、0.751、0.683，P均<0.05)。

3　討論

近年來(lái)，基于癌癥的發(fā)病率不斷上升而進(jìn)行的大量的研究發(fā)現(xiàn)，各種信號(hào)通路的異常在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前已明確結(jié)腸癌是一種多步驟多基因參與的復(fù)雜過(guò)程[8]，其中涉及多種信號(hào)通路之間的相互聯(lián)系，在諸多信號(hào)通路中，Notch信號(hào)通路成為目前結(jié)腸癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

Notch家族基因編碼一類高度保守的細(xì)胞表面受體，這些受體構(gòu)成的信號(hào)通路影響細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生的多個(gè)過(guò)程，包括細(xì)胞自我更新、細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡等[9]。Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)、CSL DNA結(jié)合蛋白、其他效應(yīng)物和Notch調(diào)節(jié)分子等組成。通過(guò)相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用而引起Notch通路的激活。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有四個(gè)Notch受體(Notch1，2，3和4)，五個(gè)Notch配體(DLL1,3,4和Jagged 1,2)[10]。在多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、皮膚癌和腦癌的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路存在異常表達(dá)和激活途徑，其中Notch信號(hào)通路的4種受體中Notch1研究最為廣泛[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，Notch信號(hào)通路在腸發(fā)育和腸上皮更新的諸多方面參與調(diào)節(jié)，并且發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路的異常激活與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在結(jié)腸腺癌中已經(jīng)檢測(cè)到有Notch1異常表達(dá)[6]。本組實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了以上研究成果，顯示Notch1分子在結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯高于結(jié)腸腺瘤的和正常黏膜組織(P<0.05)，但研究顯示這一差異在結(jié)腸腺瘤和正常黏膜組織中不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示我們Notch1的過(guò)表達(dá)在結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程的后期發(fā)揮作用。

研究顯示PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活既會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，同時(shí)也會(huì)增加癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Akt即蛋白激酶 B (PKB)，是PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子。磷酸化的p-Akt是其活化形式，Akt蛋白若未被磷酸化則不具有生物活性。經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)通路，Akt被磷酸化，生成磷酸化p-Akt而活化。Akt激酶家族由Akt1、Akt2和Akt3成員組成。研究發(fā)現(xiàn)，Akt在多種癌癥中存在過(guò)度表達(dá)問(wèn)題，其中包括結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌和部分類固醇激素不敏感性乳腺癌[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本組病例由正常結(jié)腸黏膜組織到結(jié)腸腺瘤到結(jié)腸癌，p-Akt表達(dá)率逐漸增高，且統(tǒng)計(jì)分析顯示結(jié)腸癌中p-Akt表達(dá)高于結(jié)腸腺瘤及正常黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Notch1相同，p-Akt表達(dá)在結(jié)腸腺瘤和正常黏膜組織中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示p-Akt過(guò)表達(dá)在結(jié)腸癌發(fā)生的后期發(fā)揮作用。

AKT分子的激活途徑位于Notch信號(hào)通路的下游，通過(guò)AKT分子的活化將Notch信號(hào)通路與PI3K/Akt信號(hào)通路聯(lián)系起來(lái)，共同參與疾病的發(fā)生過(guò)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌的發(fā)生過(guò)程中，Notch1和p-Akt的表達(dá)呈正相關(guān)，提示這兩個(gè)信號(hào)系統(tǒng)的相互作用對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定作用，此結(jié)果相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，是目前腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

NF-κB是高度調(diào)節(jié)的二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族集合名稱。研究表明，NF-κB參與多種生理病理過(guò)程，包括細(xì)胞生存、細(xì)胞黏附、炎癥、分化和生長(zhǎng)[13]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NF-κB包括5個(gè)亞單位：Rel(cRel)、p65(RelA,NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)，它們被組裝成同源二聚體或異源二聚體而行使生物學(xué)功能，最常見(jiàn)是p65/p50異源二聚體[14]。NF-κB的持續(xù)異常激活在諸多腫瘤研究中已見(jiàn)報(bào)道，且涉及腫瘤發(fā)生的各個(gè)階段，如胰腺癌、乳腺癌和胃癌。NF-κB被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的癌基因[14]。本組實(shí)驗(yàn)顯示NF-κB在結(jié)腸癌中存在過(guò)度激活，其在癌組織中的表達(dá)高于結(jié)腸腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但研究未顯示這一差異存在結(jié)腸腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織中，提示NF-κB過(guò)表達(dá)在結(jié)腸癌發(fā)生的后期發(fā)揮作用。

Notch信號(hào)通路中，NF-κB是其下游信號(hào)的關(guān)鍵分子，Notch信號(hào)通路與NF-κB的相互作用及之間的多重交互機(jī)制在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。迄今為止，只有Notch1 被報(bào)道與NF-κB間的相互聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Notch1和NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者的相互作用參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

uPA系統(tǒng)參與諸多生理和病理事件，包括細(xì)胞遷移和組織重塑，如胚胎發(fā)生、排卵、炎癥、傷口愈合、血管生成和腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。uPA是一種絲氨酸蛋白酶，在腫瘤研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)其參與癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。纖維蛋白溶酶原激活物在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的作用主要通過(guò)癌細(xì)胞釋放纖維蛋白溶酶原激活劑活化纖溶酶原形成纖溶酶，從而催化蛋白質(zhì)水解發(fā)揮作用。在本研究中，uPA在正常結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)率低于結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌組織中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明uPA蛋白的高表達(dá)在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。同樣，未發(fā)現(xiàn)在正常腸黏膜組織和腺瘤之間的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明uPA過(guò)表達(dá)主要與腫瘤細(xì)胞的侵襲相關(guān)。

本研究結(jié)果證實(shí)結(jié)直腸癌的發(fā)生是多基因參與過(guò)程，在不同階段，發(fā)揮作用基因及信號(hào)通路不同；不同信號(hào)通路間存在相互關(guān)聯(lián)。Notch1、NF-κB、uPA和p-Akt均參與結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程，但主要發(fā)生于由腺瘤轉(zhuǎn)換為腺癌的后期；通過(guò)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Notch1與NF-κB、NF-κB與uPA、p-Akt與NF-κB及Notch1與p-Akt表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系，表明不同的信號(hào)通路間可通過(guò)關(guān)鍵分子聯(lián)系起來(lái)，協(xié)同發(fā)揮作用，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。這四項(xiàng)指標(biāo)在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、Dukes分期有關(guān)，此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[3，4]報(bào)道一致，為結(jié)腸癌的預(yù)后判斷提供了新的標(biāo)記物。

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