IL-17BR在炎癥性腸病中的表達及其臨床意義*

蘇婧玲　謝晨曦　范燕云　胡益群　王　琳　任建林

廈門大學附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科　廈門大學消化疾病研究所　廈門市消化疾病診治中心(361004)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種病因不明的腸道非特異性炎癥性病變，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)。IBD的病因和發(fā)病機制目前仍不甚清楚，與基因易感性、黏膜免疫紊亂、腸道微生態(tài)改變以及環(huán)境作用均有一定關(guān)系[1-2]。大量研究已證實，細胞因子及其相關(guān)受體在IBD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的免疫效應(yīng)[3]。白細胞介素17B受體(interleukin-17B receptor, IL-17BR)是一種相對分子質(zhì)量為56 kDa(1 Da=0.992 1 u)的Ⅰ型單鏈跨膜蛋白，主要表達于腸道、氣管、腎臟等多種組織器官[4-5]。白細胞介素25(interleukin-25, IL-25)可與IL-17BR結(jié)合，兩者的親和力高于IL-17B。IL-25屬于Th2型細胞因子，在部分自身免疫性疾病模型中可通過啟動Th2型免疫應(yīng)答，同時抑制Th1/Th17型免疫反應(yīng)，發(fā)揮重要的炎癥調(diào)節(jié)功能[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者腸黏膜和血清中存在系統(tǒng)性IL-25表達降低[7]，但其受體IL-17BR與IBD患者腸黏膜損傷和全身炎癥活動度的關(guān)系尚不明確。本研究通過檢測IBD患者結(jié)腸黏膜和外周血單個核細胞(PBMC)中IL-17BR的表達情況，并分析其與臨床炎癥活動度和治療方案的相關(guān)性，旨在探討IL-17BR在IBD發(fā)病機制中的作用和臨床意義。

材料與方法

一、標本來源

結(jié)腸黏膜標本收集自2014年12月—2016年12月廈門大學附屬中山醫(yī)院行結(jié)腸鏡檢查的CD患者40例(其中男25例，女15例；年齡19～52歲；活動期28例，緩解期12例)和UC患者32例(其中男20例，女12例；年齡22～61歲；活動期25例，緩解期7例)。選取同期25例結(jié)腸鏡檢查無明顯異常者的結(jié)腸黏膜標本作為對照，其中男15例，女10例，年齡23～60歲。PBMC標本選自同期活動期CD患者30例(其中男17例，女13例，年齡21～54歲)、UC患者27例(其中男16例，女11例，年齡23～62歲)，對照組為同期健康體檢者25例(其中男14例，女11例，年齡24～61歲)。IBD的診斷符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[8]。IBD患者入組前1個月均未用過水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑等。所有UC和CD患者性別、年齡與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，入選者留取標本前均簽署知情同意書，本研究方案通過廈門大學附屬中山醫(yī)院倫理委員會審核。

二、主要試劑

鼠抗人IL-17BR單克隆抗體購于Novus公司，PE標記的鼠抗人IL-17BR、人TNF-α ELISA試劑盒均購于R&D公司，人淋巴細胞分離液購于GE公司。

三、研究方法

1. 免疫組化法：取入選者內(nèi)鏡活檢標本2塊，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，去除內(nèi)源性過氧化氫酶，微波抗原修復，山羊血清封閉，滴加鼠抗人IL-17BR單克隆抗體(工作濃度1∶100)4 ℃過夜，同時以PBS代替一抗作為空白對照，滴加羊抗鼠IgG二抗(工作濃度1∶200)37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，鏡檢。

結(jié)果判定：以細胞質(zhì)染色呈棕黃色為陽性細胞，每個樣本隨機選取5個高倍(×400)視野，計數(shù)IL-17BR陽性細胞數(shù)，計算IL-17BR陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比，取均值。

2. PBMC分離和流式細胞儀分析：收集外周靜脈血5 mL，用等體積PBS稀釋，加入預先裝有淋巴細胞分離液的離心管中，2 000×g離心15 min，吸取中間云霧層置于新離心管內(nèi)；加入適量PBS清洗離心，棄上清液獲得PBMC。將分離好的PBMC置于PBS溶液中重懸，調(diào)整細胞濃度至1×108/mL，取100 μL PBMC懸液加至實驗管和對照管中，然后分別加入10 μL IL-17BR抗體和10 μL同型對照抗體，吹打混勻后于室溫避光反應(yīng)15 min，PBS洗滌后去上清，加入500 μL PBS重懸后上機檢測。

3. ELISA法：抽取15例CD患者英夫利西單抗(IFX)治療前后清晨空腹肘靜脈血2 mL，1 500×g離心15 min，提取血清，-80 ℃保存待檢。嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟，測定血清TNF-α濃度。

4. 其他指標：檢測并記錄IBD患者的CRP和ESR，同時對CD和UC患者分別行克羅恩病活動指數(shù)(CDAI)[9]和Mayo評分[10]。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié)　　果

一、IL-17BR在結(jié)腸黏膜中的表達

免疫組化染色顯示，IL-17BR主要表達于結(jié)腸黏膜固有層單個核細胞內(nèi)，胞質(zhì)中可見棕黃色顆粒(圖1)?；顒悠贑D、活動期UC、緩解期CD、緩解期UC和正常對照組結(jié)腸黏膜IL-17BR陽性表達率分別為26.4%±7.2%、28.2%±8.5%、11.3%±2.5%、15.6%±2.3%和4.3%±1.8%?；顒悠?、緩解期CD和UC組IL-17BR表達均顯著高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；活動期CD、UC組均高于緩解期CD、UC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。緩解期CD與UC以及活動期CD與UC患者相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

二、IL-17BR在PBMC中的表達

流式細胞儀結(jié)果顯示，CD、UC患者和正常對照組PBMC中IL-17BR陽性表達率分別為23.6%±6.1%、20.6%±7.2%和19.5%±5.8%，組間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

三、結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與CRP、ESR、炎癥評分之間的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與CRP、ESR、CDAI評分呈正相關(guān)(r分別為0.70、0.62、0.54，P<0.01)，UC患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與CRP、ESR、Mayo評分呈正相關(guān)(r分別為0.59、0.52、0.50，P<0.01)(圖2)。

四、IFX治療前后CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR和血清TNF-α濃度

免疫組化染色結(jié)果表明，IFX治療后，15例CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR陽性率較治療前顯著降低(17.6%±7.0%對30.2%±8.2%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ELISA結(jié)果表明，IFX治療后，15例CD患者血清TNF-α濃度亦顯著降低[(85.9±13.4) pg/mL 對(138.7±26.7) pg/mL]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

A：正常對照者(免疫組化染色，×200)；B：活動期CD患者(免疫組化染色，×200)；C：活動期UC患者(免疫組化染色，×200)；D：各組IL-17BR表達比較

圖1IL-17BR在正常對照者、CD和UC患者結(jié)腸黏膜中的表達

A：CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與CRP的相關(guān)性分析；B：CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與ESR的相關(guān)性分析；C：CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與CDAI評分的相關(guān)性分析；D：UC患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與CRP的相關(guān)性分析；E：UC患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與ESR的相關(guān)性分析；F：UC患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與Mayo評分的相關(guān)性分析

圖2IBD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與臨床炎癥指標和炎癥評分的相關(guān)性分析

五、IFX治療前后CD患者血清TNF-α與結(jié)腸黏膜IL-17BR表達的相關(guān)性分析

IFX治療前，血清TNF-α濃度與結(jié)腸黏膜IL-17BR表達呈正相關(guān)(r=0.55，P<0.05)；IFX治療后，血清TNF-α濃度與結(jié)腸黏膜IL-17BR表達仍呈正相關(guān)(r=0.52，P<0.05)(圖4)。

討　　論

作為一種自身免疫性疾病，IBD的病因極其復雜，具體發(fā)病機制目前仍不清楚，但細胞免疫在其中占據(jù)關(guān)鍵地位。傳統(tǒng)觀點認為，CD發(fā)病過程是一種典型的Th1型免疫反應(yīng)，而UC傾向于一種非典型的Th2型免疫反應(yīng)，Th17細胞則在CD和UC發(fā)病中均具有重要的促炎效應(yīng)[11]。各種因素誘發(fā)的Th細胞亞群之間的平衡失調(diào)，可導致與其相關(guān)的一系列細胞因子及其受體的表達發(fā)生改變，最終引起IBD炎癥應(yīng)答的啟動激活，破壞腸道黏膜。

IL-25屬于IL-17家族的細胞因子，廣泛表達于人體多種細胞和組織中，如盲腸淋巴結(jié)的CD4+T細胞、骨髓來源的肥大細胞、過敏原刺激后的肺上皮細胞和肺泡巨噬細胞等[12]，IL-25是IL-17家族中惟一可誘發(fā)Th2型免疫反應(yīng)的成員。相關(guān)研究顯示，IL-25通過與IL-17BR結(jié)合，激活下游一系列轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、STAT6、GATA3、NF-ATC1、JUNNB、MAPK、JNK等，從而導致免疫炎癥反應(yīng)的逐級放大[13-14]。在Th2細胞相關(guān)的免疫性病變中，IL-25表達變化通常伴隨IL-17BR的相應(yīng)改變，最終共同起促炎或免疫調(diào)節(jié)的作用。Corrigan等[15]的研究表明，隨著氣管炎癥的進展，哮喘患者氣管黏膜IL-25和IL-17BR表達均顯著升高。在膠原誘導的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，關(guān)節(jié)組織中IL-17BR mRNA表達明顯升高[16]。此外，Grave病患者外周血IL-17BR表達明顯升高，且與IL-13表達呈正相關(guān)[17]。

IBD作為發(fā)生于腸道的自身免疫性疾病，炎癥的發(fā)生、發(fā)展與細胞因子網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)受體的相互作用密切相關(guān)。前期研究[7]表明，IBD患者腸黏膜和血清中存在系統(tǒng)性IL-25表達降低，且與炎癥指標(CRP、ESR)和內(nèi)鏡評分呈負相關(guān)，提示IL-25減少可能是IBD炎癥發(fā)生的重要因素之一，但其受體IL-17BR與IBD患者腸黏膜損傷和全身炎癥活動度的關(guān)系尚不明確。Caruso等[18]檢測了IBD患者結(jié)腸黏膜CD14+細胞的IL-25受體含量，發(fā)現(xiàn)IBD患者與正常人之間無明顯差異。本研究結(jié)果顯示，IL-17BR在CD和UC患者結(jié)腸黏膜中的表達顯著高于正常對照者，尤其是活動期IBD患者，提示在IBD炎癥進展過程中，IL-17BR可在結(jié)腸黏膜組織炎癥部位發(fā)揮重要的免疫效應(yīng)功能，結(jié)合其主要效應(yīng)因子IL-25表達降低，不排除IL-17BR表達升高存在反饋性調(diào)節(jié)機制。但PBMC中IL-17BR表達在IBD患者和正常對照者間無明顯差異，表明IL-17BR的免疫效應(yīng)可能僅存在于局部炎癥腸黏膜而非整體循環(huán)。同時本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與臨床炎癥指標和CDAI、Mayo評分均呈明顯正相關(guān)，提示腸黏膜IL-17BR浸潤情況可反映IBD疾病活動度，再次驗證了IL-17BR表達與腸道炎癥進展放大密不可分。

A：IL-17BR表達；B：血清TNF-α濃度

A：IFX治療前；B：IFX治療后

TNF-α與其他細胞因子共同參與了IBD炎癥的發(fā)生，IFX已廣泛應(yīng)用于臨床治療中，對中-重度CD具有良好的療效。本研究進一步比較發(fā)現(xiàn)，CD患者IFX治療后結(jié)腸黏膜IL-17BR表達較治療前顯著下降，血清TNF-α濃度亦降低，且治療前后均與IL-17BR表達呈正相關(guān)。提示結(jié)腸黏膜IL-17BR表達升高與TNF-α高水平相關(guān)，TNF-α在IL-17BR相關(guān)信號通路中可能具有重要作用。但本研究CD患者的蒙特利爾分型不同，不排除在統(tǒng)計中可能出現(xiàn)偏倚，需在后續(xù)研究中進一步分類驗證。

綜上所述，結(jié)腸黏膜IL-17BR表達與IBD炎癥程度變化密切相關(guān)，同時與TNF-α水平存在關(guān)聯(lián)，IL-17BR可能參與了IBD腸黏膜炎癥應(yīng)答，因此可作為反映IBD疾病活動度的指標之一。

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